家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin6基因轉(zhuǎn)錄特異性分析及多克隆抗體制備.pdf

1、為研究家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin6基因（Bmserpin-6）與家蠶表皮黑化硬化、蛻皮變態(tài)、先天性免疫等生理過程的關(guān)系，以家蠶（大造）為材料，采用實時熒光定量PCR方法，分析了家蠶多個發(fā)育時期，多個組織中Bmserpin-6基因轉(zhuǎn)錄變化。用脂多糖（lipopolysac charide,LPS）刺激5齡第3d家蠶，分析了刺激后不同時間點，脂肪體和血液中Bmserpin-6基因轉(zhuǎn)錄變化。同時將pET28a-serpin6原核表達(dá)載

2、體轉(zhuǎn)化到宿主菌，表達(dá)家蠶serpin6融合蛋白，重組融合蛋白經(jīng)純化回收，以此為抗原免疫昆明小鼠，成功制備了Bmserpin-6多克隆抗體。主要結(jié)果如下：
　?。ㄒ唬┘倚Qserpin6基因轉(zhuǎn)錄特異性分析
　?。?）提取家蠶4齡幼蟲（1～4 d）頭部、表皮、脂肪體、中腸和絲腺總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR檢測表明，Bmserpin-6基因在家蠶4齡幼蟲（1～4 d）的頭部、表皮、脂肪體、中腸和絲腺都有轉(zhuǎn)錄，其中表

3、皮中Bmserpin-6轉(zhuǎn)錄水平較高，與黑色素合成基因在家蠶表皮組織高表達(dá)具有一致性，由此推測Bmserpin-6可能參與了家蠶表皮黑色素沉積。提取3齡、4齡幼蟲蛻皮過程中表皮總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR檢測表明，3齡、4齡幼蟲蛻皮過程，Bmserpin-6在家蠶眠時轉(zhuǎn)錄水平降低，在將眠蠶和起蠶表皮中的轉(zhuǎn)錄量高于眠蠶，且起蠶轉(zhuǎn)錄水平明顯上升。推測Bmserpin-6參與了家蠶蛻皮過程中表皮的黑化硬化。
　?。?）

4、提取5齡家蠶不同組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR檢測5齡家蠶不同組織，馬氏管、中腸、絲腺、脂肪體、頭部、表皮、精巢和卵巢中mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明：在5齡第2d、第6 d和第7d，Bmserpin-6在表皮中的轉(zhuǎn)錄量明顯高于其它組織，在5齡第1d、第3d和第4d，在頭部的轉(zhuǎn)錄量明顯高于其它組織，Bmserpin-6在5齡家蠶（1～7d）各組織轉(zhuǎn)錄具有明顯的時空特異性。5齡家蠶（1～7d）頭部組織中Bmserpin-6轉(zhuǎn)

5、錄比較，結(jié)果表明：在5齡初期至中期轉(zhuǎn)錄水平呈上升狀態(tài)，5齡第4天達(dá)到最高值，5齡第5天轉(zhuǎn)錄水平突然降低，直至齡末一直低水平轉(zhuǎn)錄。與保幼激素的分泌趨勢大致相同，家蠶頭部為主要的內(nèi)分泌器官，推測 Bmserpin-6與家蠶變態(tài)發(fā)育過程中的激素分泌相關(guān)。
　?。?）LPS刺激后Bmserpin-6基因的轉(zhuǎn)錄分析
　　LPS刺激5齡第3d家蠶，實驗組每頭注射10微升脂多糖，對照組每頭注射10微升無菌水。分別取注射后3、6、9、12和

6、24h五個時間點的脂肪體與血淋巴，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR檢測表明，LPS刺激后，脂肪體和血淋巴中Bmserpin-6基因轉(zhuǎn)錄水平都明顯上升。免疫刺激后在血液中9h時，Bmserpin-6基因轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高值，9h后逐漸降低至正常水平；在家蠶脂肪體中6h時，Bmserpin-6基因轉(zhuǎn)錄水平最高，且在24h時又有一個高峰。
　?。ǘ?Bmserpin-6的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　?。?）將重組

7、質(zhì)粒pET28a-serpin6轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，表達(dá)的重組蛋白使用鎳柱純化回收含6×his的融合蛋白。并采用SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)，與對照組相比，能夠檢測到一條分子量約為45kDa的特異性條帶。檢測結(jié)果說明Bmserpin-6的融合蛋白在大腸桿菌中得到成功表達(dá)。
　?。?）將在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的Bmserpin-6融合蛋白，經(jīng)鎳柱純化回收，以此為抗原，采用四次免疫方式，注射昆明小鼠進(jìn)行抗原

8、免疫，制備Bmserpin-6多克隆抗體血清。經(jīng)Western blot和Elisa檢測驗證，特異性較高、效價達(dá)1:20000。
　　本研究通過實時熒光定量PCR的方法對Bmserpin-6轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因在家蠶表皮及頭部組織具有轉(zhuǎn)錄特異性。推測Bmserpin-6參與家蠶表皮的黑化硬化，且在蛻皮變態(tài)發(fā)育過程中可能與激素的分泌相關(guān)。經(jīng)免疫刺激后，Bmserpin-6的轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明，該基因可能主要參與了脂肪體的免疫反應(yīng)。