hplc定量分析方法

1、,HPLC法,高效液相色譜法,High performance liquid chromatography (HPLC),了解HPLC色譜儀的構(gòu)成熟悉HPLC法分類及方法掌握HPLC法的定義、特點掌握HPLC法實驗條件的選擇掌握HPLC法的定量分析方法,教學大綱,用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入進樣閥的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色

2、譜信號。,HPLC法的定義、特點,一、定義,二、特點,1.適用范圍廣（可分析80%有機化合物）2.分離性能好3.分析速度快4.靈敏度高5.色譜柱可反復使用6.流出組分容易收集,,,©2006,Baidu 免責聲明 與百度對話,HPLC實驗條件的選擇,1. HPLC前處理2. 色譜柱的選擇3. 流動相的選擇4. 洗脫方式的選擇5. 檢測器的選擇,HPLC前處理,1. 流動相的處理2. 樣品的處理,流動相的處理

3、,1. 溶劑的純化2. 流動相脫氣3. 過濾,4. 色譜純試劑5. 重蒸水,流動相的處理,過濾：除去固體微粒,親水、親脂、兩用；0.45µm,流動相的處理,,流動相脫氣,脫氣：除去流動相中的空氣方法：超聲波振蕩脫氣、惰性氣體鼓泡吹掃脫氣、抽真空、加熱脫氣、在線脫氣系統(tǒng),樣品的處理,除去雜質(zhì)、純化樣品濃縮樣品或進行衍生化過濾,HPLC前處理,樣品的處理 供試品溶液的制備,,提取,純化,,濃縮 or 衍生化,,H

4、PLC樣品,,處方,劑型,待測成分的理化性質(zhì),干擾成分的理化性質(zhì),色譜柱的選擇,根據(jù)被分離物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)、極性和溶解度,色譜柱的長度與分離效果,正相色譜柱：固定相極性大于流動相，一般指硅膠柱，以正己烷系列為流動相。正相色譜法主要用于分離分析能溶于有機溶劑的極性及中等極性分子型物質(zhì),,色譜柱的分類,反相色譜柱：固定相極性小于流動相，其技術(shù)就是在硅膠基質(zhì)上鍵合有機碳鏈。一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水為流動相。 反相色譜法

5、適用于非極性及中等極性化合物目前用的最多的色譜柱是反相鍵合相色譜柱 最常用：（octadecylsilane) ODS柱/C18 （十八烷基鍵合相）,,色譜柱的分類,鍵合相的優(yōu)點,①使用過程不流失②化學性能穩(wěn)定，在PH2-8的溶液中不變質(zhì)③熱穩(wěn)定性好，一般在70℃以下穩(wěn)定④載樣量比硅膠約大一個數(shù)量級⑤適于作梯度洗脫,,,,,避免壓力和溫度的急劇變化和任何機械震動樣品要進行預處理；在分析柱前安裝保護柱（如分析柱是鍵合硅

6、膠，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解）流動相要適宜，不能對固定相產(chǎn)生破壞注意色譜柱的pH使用范圍、耐壓限度注意色譜柱的方向性，色譜柱不能反沖（除非指明）,色譜柱的使用和維護,每次色譜分析完成后，要及時對色譜柱進行沖洗保存色譜柱在合適的溶劑中（應將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。）,色譜柱的使用和維護,流動相的

7、選擇,固定相一定時，流動相的種類、配比、pH值及添加劑等能顯著影響分離效果，HPLC中流動相的選擇至關(guān)重要。,對流動相的基本要求,①不與固定相發(fā)生化學反應②對樣品有適宜的溶解度 要求容量因子k在2～5 (最佳) 或1～10 (可用) k值太小，不利于分離；k值太大，可能使樣品在流動相中沉淀③必須與檢測器相適應 例如用紫外檢測器時避免末端吸收④粘度小,容量因子(capacity factory):也稱為分配容量（

8、partition volume）、容量比（capacity ratio），是在達到分配平衡后，組分在固定相中的量與流動相中的量之比。也稱為質(zhì)量分配系數(shù)。,流動相的選擇,反相鍵合相色譜正相鍵合相色譜反相離子對色譜,鍵合相色譜法：化學鍵合相為固定相的色譜法，分離機制以分配作用為主，對不封尾的鍵合相還有一定的吸附作用。應用最廣泛的色譜法,用化學反應將鍵合相的載體硅膠的殘存硅醇基去掉的方法，稱為封尾或遮蓋（end-capping）,形

9、成的鍵合相稱為封尾鍵合相。,反相鍵合相色譜流動相的選擇,1.部分含水溶劑：水為基礎溶劑，再加入可與水互溶的有機極性調(diào)節(jié)劑（如甲醇、乙腈、四氫呋喃） 適用于分離中等極性、弱極性藥物 常用甲醇－水、乙腈－水系統(tǒng) 有機極性調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)及其與水的比例對保留值和分離選擇性有影響,反相鍵合相色譜流動相的選擇,2.緩沖溶液常用的緩沖液：三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液。適用于可溶于水并具可解離特性的化合物，如蛋白質(zhì)及弱酸、弱堿類化合物。緩

10、沖液及PH不同、及所占比例不同會影響組分的保留值,注意,由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸縮狀態(tài)，故對于C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5％，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定,,,,反相鍵合相色譜流動相的選擇,3.非水溶劑流動相為不含水系統(tǒng)。用于分離疏水性物質(zhì)。在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氫呋喃。這種色譜法稱為非水反相色譜法。,正相鍵合相色譜流動相的選擇,流動相采用飽

11、和烷烴（如正己烷）中加入極性較大的溶劑為極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醚），通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度來改變?nèi)軇姸取?反相離子對色譜流動相的選擇,是極性較強的水系統(tǒng)混合溶劑最常用的是甲醇－水、乙腈－水中加入0.003-0.01mol/L的離子對試劑離子對試劑的性質(zhì)、濃度、流動相的PH及流動相中有機溶劑的性質(zhì)和比例都會影響組分的保留值和分離效果,洗脫方式的選擇,等度洗脫梯度洗脫,1洗脫的類型等度洗脫 在一個分析周期內(nèi)流動相的組成保持恒

12、定 適合于組分數(shù)目較少、性質(zhì)差別不大的樣品,洗脫方式的選擇,葛根芩連湯中葛根素的含量,流動相: 甲醇：乙腈：水(12∶8∶80)流速: 1.0 mL/min 柱溫: 室溫,1、洗脫的類 梯度洗脫 在一個分析周期中，程序控制流動相的組成改變（如溶劑的極性、離子強度、pH值等），使每個組分都在適宜的條件下獲得分離。 適合于組分數(shù)目較多、組分間k值相差較大（10-100倍）的復雜混合物,洗脫方式的選擇,優(yōu)點

13、縮短分析時間，提高分離度，改善峰形。使峰變尖銳，使微量組分容易被檢出，提高檢測靈敏度缺點 常常會引起基線漂移，重現(xiàn)性較等度洗脫差,2、梯度洗脫的特點,梯度洗脫的特點,標準品,樣品,HPLC梯度洗脫條件,1.要注意溶劑的互溶性，不相混容的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相2.所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性3.混合溶劑的粘度常隨組成而變化4.每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態(tài)。需讓10-30倍柱

14、容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡,2、梯度洗脫的特點,梯度洗脫需注意內(nèi)容,檢測器的選擇,分 類,1.紫外檢測器（ultraviolet detector;UV)2.熒光檢測器（fluorophtometric detector;FD)3.蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector; ELSD)4.電化學檢測器（electrochemical detec

15、tor；ECD)5.示差折光檢測器（differential refractive index detector；DRID）6.化學發(fā)光檢測器（chemiluminescence detector;CLD)7.質(zhì)譜檢測器(mass spectrometry detector;MSD),檢測器的選擇,1.優(yōu)點靈敏度高，最低檢出量可達10-7～10-12 g 不破壞樣品，可用于制備 對溫度及流動相波動不敏感，可用于梯度洗脫,紫外

16、檢測器（最普遍）,2.缺點只能檢測具有紫外吸收或衍生物具有紫外吸收的 物質(zhì)流動相的截止波長必須小于檢測波長,紫外檢測器（最普遍）,3.種類⑴可變波長紫外檢測器（UVD）配制最多,⑵光電二極管陣列檢測器 （photodiode array detector; PDAD或DAD）,紫外檢測器（最普遍）,,特點 可以快速掃描被測組分的的紫外可見吸收光譜?？梢酝瑫r獲得樣品的色譜圖及每個組分的吸收光譜。特殊功能 a

17、、色譜峰的準確定性 b、峰純度檢驗 c、多通道檢測 d、峰抑制 e、寬譜帶檢測 f、選擇最佳波長,光電二極管陣列檢測器,a、色譜峰的準確定性 先取得該峰的光譜圖,再與標準樣品的光譜圖進行比較,若兩個光譜完全重合,說明是同一種物質(zhì);若不重合,說明是不同種物質(zhì)。,,光電二極管陣列檢測器,,,,光電二極管陣列檢測器,b、峰純度檢驗 在色譜分析中,通常

18、利用吸收比確定峰的純度。二極管陣列檢測器既可使用吸收比的方法,又可使用比較光譜的方法。在峰的前沿、后沿和最大值處各取一點,掃出這三點的光譜圖進行比較,若三個光譜圖完全重合,說明是純峰(只含一種物質(zhì)) ,若不完全重合,說明峰中含有雜質(zhì)。,對于任何在紫外-可見光區(qū)有吸收的純物質(zhì)在兩個選定波長下的吸收比為一常數(shù)，且與濃度無關(guān),,,d、峰抑制 如果兩種化合物沒有完全分離,但它們的光譜圖有很大差別,就可以通過選擇合適的測量波長、參考波長和

19、帶寬,使一種化合物被完全抑制。,光電二極管陣列檢測器,1.優(yōu)點靈敏度極高，比紫外檢測器高一個數(shù)量級良好的選擇性線性范圍較寬受外界條件影響較小只要選作流動相的溶劑不發(fā)熒光，熒光檢測器就能用于梯度洗脫高靈敏度和高選擇性，適于體內(nèi)藥物分析,熒光檢測器,2.缺點只適于檢測能產(chǎn)生熒光或衍生物能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。應用不如紫外檢測器廣流動相不能含有熒光物質(zhì)或使熒光熄滅的物質(zhì),應用：氨基酸、多環(huán)芳烴、甾體化合物、酶,熒光檢測器,蒸發(fā)光散

20、射檢測器,色譜柱后流出液（流動相+組分）先引入已通氣體（常用高純氮或空氣）的霧化器，流出物與通入的氣體形成均勻的微小液滴，經(jīng)過蒸發(fā)器（漂移管）加熱，蒸發(fā)除去流動相，而樣品組分在蒸發(fā)器內(nèi)形成氣溶膠，然后進入檢測室。用強光或激光照射氣溶膠而產(chǎn)生光散射（丁鐸爾效應），用光電二級管檢測散射光強度，從而獲得組分的濃度信號。散射光強度的對數(shù)與組分質(zhì)量的對數(shù)成線性關(guān)系。,蒸發(fā)光散射檢測器,1.優(yōu)點通用型檢測器。對各種物質(zhì)幾乎都有響應靈敏度比示差折

21、光檢測器高流動相系統(tǒng)溫度變化影響不敏感可進行梯度洗脫沒有流動相的紫外吸收干擾,蒸發(fā)光散射檢測器,2.缺點分析范圍受樣品組分和流動相揮發(fā)性的限制流動相中如含緩沖溶液，緩沖溶液必須受到限制：必須是揮發(fā)性，并且濃度應盡可能低，不能用含緩沖鹽的流動相。通常選用的緩沖溶液有：甲酸、乙酸、三氟乙酸等是一種破壞型檢測器，不能配備制備型的高效液相儀進行樣品的純化制備比紫外檢測器靈敏度低,蒸發(fā)光散射檢測器,3.在中藥分析中的應用中藥的化學

22、成分復雜，有一部分成分不存在紫外吸收或僅在紫外末端有吸收。紫外檢測器難于檢測。ELSD在某種程度彌補了這方面的不足用于糖類、氨基酸、甾體等化合物,黃芪：黃芪甲苷，200.8nm末端紫外吸收,蒸發(fā)光散射檢測器,,,,電導檢測器：用于離子色譜極譜檢測器庫侖檢測器安培檢測器,電化學檢測器,,伏安檢測器,,能氧化、還原的物質(zhì),,檢測限達10-12 g /ml，痕量組分分析,特點：通用型檢測器對多數(shù)物質(zhì)的靈敏度低（約10-5 g /m

23、l），不能用于痕量分析適合于糖類的檢測（檢測限可達10-8g /ml）受環(huán)境溫度、流動相組成等波動的影響大，不適合梯度洗脫,示差折光檢測器,高選擇性、高靈敏度的新型檢測器是分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺的最佳選擇,化學發(fā)光檢測器,HPLC-MS能提供的質(zhì)譜信息準確的化合物分子量信息未知化合物碎片結(jié)構(gòu)信息一套完整的圖譜和多種掃描方式充分提供定性、定量和峰純度信息可用于無共價鍵、無功能團的化合物,質(zhì)譜檢測器,幾種檢測器的主要性能,

24、化學鍵合相色譜法 BPC（最廣泛）膠束色譜法 MC手性色譜法 CC,HPLC法分類及方法,借助于化學反應的方法將固定液的官能團鍵合在載體的表面而構(gòu)成化學鍵合相。,化學鍵合相色譜法,反相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法離子對色譜法離子抑制色譜法,反相鍵合相色譜法,適用于非極性與中等極性的化合物非極性鍵合相：十八烷基鍵合相是最常用的固定相（ODS) 05版藥典一部流動相：水+極性調(diào)節(jié)劑,正相鍵合相色譜法,適用于溶于有

25、機溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)。如：酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等常用的極性鍵合相：氰基（－CN)、氨基（－NH2)和二醇基(DIOL) 常用的流動相：烷烴（常用正己烷）+極性調(diào)節(jié)劑極性調(diào)節(jié)劑：乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等,氰基鍵合相：分離選擇性與硅膠相似，對雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好選擇性氨基鍵合相：較強的氫鍵結(jié)合能力，對含有甾體、強心苷等官能團的化合物有較好的分離能力；與糖類分子的羥基產(chǎn)生選擇

26、性。 氨基柱用作分析糖類的專用色譜柱，但不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等。因為存在Schiff堿反應。,正相鍵合相色譜法,含義：直接將離子對試劑加入到流動相中，用以分離離子型或可離子化化合物的方法稱為離子對色譜法。分類：反相離子對色譜法;正相離子對色譜法反相離子對色譜法：以C18或C8鍵合相為固定相，含離子對試劑的有機溶媒－水溶液為流動相適用于有機酸、堿、鹽的分離,離子對色譜法,1.離子對試劑的選擇：選用的離子對試

27、劑的電荷應與試樣離子的電荷相反。 分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用帶負電荷的烷基磺酸鹽或烷基硫酸鹽 如：己烷基磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉等 分析酸類或帶負電荷的物質(zhì)：用帶正電荷的季胺鹽 如：四甲胺、四丁胺、十六烷基三甲胺、三辛胺等 離子對試劑的濃度一般為：3-10mmol/L,反相離子對色譜法,2.流動相ph值的控制調(diào)節(jié)ph值可在較大范圍內(nèi)改變?nèi)跛?、弱堿樣品的保留值和分離選擇性 因采用的是以硅膠為基體烷基

28、鍵合相，流動相的ph應在2-8范圍內(nèi)調(diào)整3.有機溶劑的選擇：甲醇－水；乙腈－水系統(tǒng),反相離子對色譜法,反相離子對色譜法特點,采用反相鍵合液相色譜柱，在一般的HPLC儀器上就可運行，它兼有反相色譜和離子交換色譜共同的優(yōu)點，分析速度快，效率高，操作簡便。適用于有機酸、生物堿的分離，以及用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離。缺點：離子對試劑價格較貴。,離子抑制色譜法,定義 通過向流動相中加入少量弱酸（常用醋酸）、

29、弱堿（常用氨水）、或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽），調(diào)節(jié)流動相的pH值，抑制組分的離解，增加組分在固定相中的溶解度，并改善峰形，以達到分離有機弱酸、 弱堿的目的。這種技術(shù)叫離子抑制色譜法。,離子抑制色譜法通常用于反相鍵合相色譜中，組分的保留值除與一般的反相鍵合色譜法有相同的影響因素外，還受流動相的pH值影響。流動相的PH值要在2-8之間,離子抑制色譜法特點,離子抑制色譜法與離子對色譜法的區(qū)別,1.離子抑制色譜法是向流動相中加入抑制劑以抑

30、制組分自身解離。所加抑制劑為低分子有機或無機弱酸、弱堿或鹽。抑制子（反離子）是樣品本身所具有的離子。2.離子對色譜法則是向流動相中加入離子對試劑。離子對試劑是有機兩性化合物、表面活性劑。離子對試劑的反離子與組分離子結(jié)合成中性離子對。,,一、定量方法二、方法學建立,HPLC的定量方法,二、方法學建立,（一）專屬性（二）線性關(guān)系考察（三）精密度試驗（四）準確度試驗（五）穩(wěn)定性試驗（六）檢測靈敏度及檢測限的測定,1.根據(jù)被分析樣

31、品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。2.選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格(柱內(nèi)徑及柱長)和選用固定相(粒徑及孔徑)。3.根據(jù)被分析樣品特性選擇合適的檢測器。 4.優(yōu)化分離操作條件，確定流動相的組成、流速及洗脫方法。5.建立分析方法并進行驗證（方法學考察）6.樣品分析。由獲得的色譜圖進行定性和定量分析。,小結(jié),建立HPLC分析方法的步驟,1.樣品的溶解度樣品溶于非極性有機溶劑樣品溶于極性有機溶劑樣品溶于