細(xì)胞受精過程課件

1、第二章 受精,受精（fertilization）是兩性生殖細(xì)胞融合產(chǎn)生具備雙親遺傳潛能新個(gè)體的過程，是新個(gè)體的開始.1.將父母的基因傳給子代2.在卵母細(xì)胞質(zhì)中激發(fā)一系列確保發(fā)育正常進(jìn)行的反應(yīng)卵母細(xì)胞成熟，精子的獲能，精卵的識(shí)別，受精過程中的重要反應(yīng)，卵新陳代謝的激活,第一節(jié) 精子和卵子的結(jié)構(gòu),精子通常分頭部、頸部和尾部三部分.頭部：細(xì)胞核和頂體頸部：近端中心粒到遠(yuǎn)端中心粒尾部：分三部分1. 中段：從基粒到環(huán)2

2、. 主段：最長(zhǎng)，負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)3. 末段：5-7μm。,卵子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)分布不均，卵黃小板在植物極聚集濃縮，糖原顆粒、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂質(zhì)等移向動(dòng)物極。細(xì)胞膜下高爾基復(fù)合體形成皮質(zhì)顆粒。卵子成熟的形態(tài)標(biāo)記是卵母細(xì)胞核膜破裂（又稱生發(fā)泡破裂;germinal vesicle breakdown，GVBD）.,第二節(jié) 卵母細(xì)胞成熟和排放,多數(shù)動(dòng)物的長(zhǎng)足卵母細(xì)胞長(zhǎng)期停止于第一次減數(shù)分裂雙線期，在適當(dāng)信號(hào)刺激下恢復(fù)減數(shù)分裂，到第二次減數(shù)分裂

3、中期停止，成為等待受精的成熟卵。在外源信號(hào)作用下卵母細(xì)胞成熟。誘發(fā)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的信號(hào)：海膽，1-甲基腺嘌呤；兩棲類，孕酮；哺乳類，4,4-二甲基-5α-膽甾基-8,14,24-三烯-3β-酚(簡(jiǎn)稱FF-MAS)。卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)記：生發(fā)泡破裂，染色體聚集，紡錘體形成和第一極體排出。在分子水平變化：細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度下降, Ca2+濃度上升，蛋白質(zhì)合成增加 (磷蛋白pp39mos，促成熟因子MPF)排卵(ovulation

4、)：在體內(nèi)外諸因素(環(huán)境，神經(jīng)，激素，酶等)作用下卵子由卵巢排出. 只有適當(dāng)成熟的卵子才能受精.,長(zhǎng)主卵母細(xì)胞由依賴cAMP的PKA 磷酸化的蛋白質(zhì)控制（因外源信號(hào)能迅速導(dǎo)致卵母細(xì)胞cAMP含量下降），停頓在第一次減數(shù)分裂的雙線期。該蛋白去磷酸化之后，卵內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加。啟動(dòng)卵母細(xì)胞成熟分裂恢復(fù)的活動(dòng)發(fā)生在細(xì)胞周期的晚G2相。由外源信號(hào)導(dǎo)致卵母細(xì)胞cAMP含量下降.在翻譯的蛋白合成產(chǎn)物中，最引人注目的是pp39mos和MPF。長(zhǎng)足

5、卵母細(xì)胞質(zhì)中貯存著母型c-mos mRNA，經(jīng)外源信號(hào)刺激，母型c-mos mRNA加poly(A)尾，由此翻譯出相對(duì)分子質(zhì)量3.9 X 104的磷蛋白pp39mos 。該蛋白只在成熟過程中出現(xiàn)，受精后迅速降解.pp39mos具恢復(fù)卵減數(shù)分裂并使之停頓在第二次減數(shù)分裂的作用，但必須與Cdk2共同作用才能實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞靜止因子(cytostatic factor,CSF) 由pp39mos和Cdk2組成 .,MPF由調(diào)節(jié)亞基Cyclin B

6、與催化亞基p34cdc2組成，其活化不依賴卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平的活動(dòng)，依賴于翻譯水平的活動(dòng)。Cyclin B是一種周期性合成和降解的蛋白質(zhì)，對(duì)p34cdc2的去磷酸化和磷酸化具調(diào)節(jié)作用。Cyclin B與預(yù)存在卵中無激酶活性的p34cdc2結(jié)合在一起，形成低活性的MPF前體。在磷酸酯酶(cdc25基因產(chǎn)物)作用下，MPF前體中p34cdc2的Thr一14和Tyr一15被去磷酸化, Thr - 161保持原有被磷酸化的狀態(tài)，成為具激酶活性

7、的MPF?；罨腗PF具自我擴(kuò)增作用，即通過(間接)活化Cdc25進(jìn)一步使更多的MPF前體活化。在一定量的MPF作用下，細(xì)胞即可跨入M相.,隨著受精，受精卵內(nèi)游離Ca2+增加，鈣調(diào)蛋白激活，使依賴鈣調(diào)蛋白的酪蛋白激酶II (CKII ) 活化。隨著CKll的活化，c-mos基因產(chǎn)物pp39mos降解，Cdc2激酶失活，導(dǎo)致CSF解體，受CSF保護(hù)的CyclinB降解，細(xì)胞周期就此由M相跨入G1相.,不同動(dòng)物卵子排出時(shí)的狀況：,各種動(dòng)物

8、所排出的卵子的成熟階段不一致，大致有四種情況:①受精在生發(fā)泡破裂之前，即處于初級(jí)卵母細(xì)胞時(shí)期，精子入卵后才完成兩次減數(shù)分裂。如海綿、蛔蟲、沙蠶、箭蟲等.②受精在第一次減數(shù)分裂中期。例如貽貝、玻璃海鞘、毛翼蟲、蛤等。③受精在第二次減數(shù)分裂中期。如絕大多數(shù)脊椎動(dòng)物和文昌魚④受精在已經(jīng)完成兩次減數(shù)分裂之后.例如海膽、腔腸動(dòng)物等.有時(shí)把②③稱為中間型。另外，以上劃分并不十分嚴(yán)格，有許多例外，如海膽在受精過程中發(fā)現(xiàn)以上四種情況都有.,第

9、三節(jié) 精子的獲能,新射出的精子不能受精卵子，必須經(jīng)過獲能(capacitation)。獲能是精子在生殖道獲能因子作用下發(fā)生一系列變化獲得受精能力的過程。其中的激酶(獲能因子)有依賴 cAMP 的 PKA，磷脂激活的蛋白激酶（PKC）和酪氨酸激酶。1. PKA：在小鼠精子獲能期間，腺苷酸環(huán)化酶活性和cAMP 合成均增加，PKA的兩種不同成分 PKI 和 PKA的調(diào)節(jié)亞單位可抑制獲能反應(yīng)。2. PKC：參與精子運(yùn)動(dòng)和頂體反應(yīng)，用ph

10、orbol ester (佛波酯)刺激PKC可加速精子獲能。3. 酪氨酸激酶：用磷酸化酪氨酸抗體發(fā)現(xiàn)小鼠精子中3種不同的磷酸化蛋白：52kDa、75kDa和95kDa。后兩種只在獲能精子中磷酸化，為獲能專一的標(biāo)記物.,源于雄性生殖道的受精促進(jìn)膚受精促進(jìn)膚(fertilization promoting peptide , FPP)在精子獲能中起一定作用。FPP是前列腺分泌的三肽。將FPP加入到未獲能的小鼠和人精液中，可實(shí)現(xiàn)獲能反應(yīng)和

11、提高受精/穿透能力。FPP尚可抑制精子頂體的丟失，使精子維持較高受精能力腺苷( adenosine)能調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性，對(duì)獲能和未獲能的兩種精子產(chǎn)生的作用與FPP的作用相似。FPP結(jié)構(gòu)上與促甲狀腺素釋放激素( thyrotrophin一releasing hormone, TRH)相似，與TRH 抗體有交叉反應(yīng)。哺乳動(dòng)物前列腺和精液中含TRH類似物，從兔前列腺中已分離出TRH類似物。FPP可以誘發(fā)與精子相關(guān)的生物學(xué)反應(yīng)，可以

12、最大限度保持精子的受精能力。,第四節(jié) 精卵的識(shí)別,精卵識(shí)別有距離識(shí)別和接觸識(shí)別距離識(shí)別見于體外受精動(dòng)物的向化性距離識(shí)別效應(yīng)；接觸識(shí)別中精子與濾泡細(xì)胞、透明帶(zone pellucida，ZP)和卵黃膜在三個(gè)獨(dú)立的水平精確的相互作用，其中精子與透明帶相互作用為專一的反應(yīng)，可誘導(dǎo)頂體反應(yīng)(acrosomal reaction).頂體反應(yīng)的作用在于釋放頂體內(nèi)的酶和使精子膜成分重新分配、暴露或被修飾。精卵不僅互相粘附，同時(shí)進(jìn)行融合，

13、并誘發(fā)卵中的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致生物學(xué)事件發(fā)生.一. 精子的向化性：許多動(dòng)物卵母細(xì)胞在完成第二次減數(shù)分裂后釋放物種特異的向化因子。海膽卵膠膜中分離出含14個(gè)氨基酸的精子激活肽resact，可吸引精子.二. 具受體功能的精子表面蛋白：已發(fā)現(xiàn)動(dòng)物精子在與透明帶糖蛋白結(jié)合中存在起受體作用的精子表面蛋白。主要有：,1. 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalTase)：精子和體細(xì)胞均表達(dá)，是細(xì)胞表面的，末端具有N-乙酰葡萄糖胺的寡糖苷配體的受體?；罹颖砻?/p>

14、的GalTase能選擇的與ZP3 (精子結(jié)合蛋白)作用，將半乳糖特異的轉(zhuǎn)移到ZP3。GalTase與其配體結(jié)合，能激活精子的G蛋白并誘導(dǎo)頂體反應(yīng)2. SP56（透明帶附著分子，半乳糖結(jié)合蛋白）：位于頂體完整精子的頭部，能與ZP3結(jié)合，可能結(jié)合ZP3上寡糖的一種外源凝集素. 是一種睪丸獨(dú)有的細(xì)胞膜蛋白.3. P95：能與ZP3結(jié)合，特點(diǎn)是它的酪氨酸被磷酸化。小鼠 p95 與 ZP3 結(jié)合將激活 p95 中酪氨酸激酶活性啟動(dòng)一連串信號(hào)

15、，導(dǎo)致頂體反應(yīng)。精子與透明帶的相互作用，誘導(dǎo)頂體反應(yīng)，釋放頂體內(nèi)的酶類和使精子膜成分重新分配、暴露或被修飾。精卵不僅互相黏附，同時(shí)進(jìn)行膜融合，并引發(fā)卵內(nèi)一系列反應(yīng)，使卵被激活.,,第五節(jié) 受精過程中的重要反應(yīng),一.頂體反應(yīng)(acrosomal reaction)精子與卵子表面接觸或與卵膜分泌的物質(zhì)相遇后精子頂體發(fā)生一系列變化，即頂體反應(yīng)頂體反應(yīng)先從頂體排出內(nèi)含物，然后伸出長(zhǎng)短不一的頂體絲(acrosmal filament)與卵

16、膜接觸，釋放內(nèi)含物溶解周圍卵膜，形成一通道.,1. 精子與透明帶的初級(jí)結(jié)合已獲能精子可穿過卵丘層到達(dá)透明帶與之結(jié)合發(fā)生頂體反應(yīng)。從小鼠透明帶中分離出一種83kDa的糖蛋白（ZP3), 當(dāng)精子與其孵育后可抑制它與透明帶的結(jié)合，另外兩種糖蛋白ZP1和ZP2并不抑制這種結(jié)合。現(xiàn)已證明精子和透明帶結(jié)合的關(guān)鍵是ZP3糖蛋白上的終端半乳糖。精子表面具有三種結(jié)合透明帶的蛋白質(zhì)：結(jié)合ZP3半乳糖殘基的56kDa的蛋白質(zhì)、精子蛋白(一種糖基轉(zhuǎn)移酶

17、)和一種精子蛋白酶。,2. 精子與透明帶的次級(jí)結(jié)合頂體反應(yīng)期間精子前部的細(xì)胞質(zhì)膜從精子中放出, 這是與ZP3結(jié)合的蛋白質(zhì)位點(diǎn)。精子保持與透明帶結(jié)合以便溶解出一條穿過的通道.小鼠精子次級(jí)結(jié)合透明帶由內(nèi)頂體膜上的蛋白質(zhì)完成，它特異地結(jié)合于ZP2，頂體完整的精子不能結(jié)合ZP2。(透明帶的結(jié)構(gòu)是由重復(fù)的ZP2和ZP3單位組成，偶爾有一個(gè)ZP1插入) (右圖)。頂體反應(yīng)過的精子與透明帶的結(jié)合從ZP3轉(zhuǎn)移到相鄰的ZP2 分子上.豬中結(jié)合于Z

18、P2的好象由原頂體粒蛋白(proacrosin)調(diào)節(jié)，它結(jié)合于透明帶，此后變成一種蛋白酶——頂體粒蛋白(acrosin)，可局部消化透明帶.,3. 頂體反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制1)離子調(diào)控 Ca2+起主導(dǎo)地位。哺乳動(dòng)物精子中，鈣主要分布于頂體區(qū)、頂體后區(qū)的頂體外膜表面，及精子質(zhì)膜內(nèi)表面，Ca2+貯存區(qū)是頂體反應(yīng)的激烈區(qū)。膜上有Ca 2+泵、Na + / Ca 2+交換器和鈣離子通道3個(gè)Ca 2+轉(zhuǎn)移系統(tǒng)參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca 2+濃度。 Ca

19、 2+內(nèi)流是早期頂體反應(yīng)的關(guān)鍵，在小鼠、豬、牛、豹中已獲證實(shí)。Ca 2+內(nèi)流依賴于Na + / Ca 2+交換 。除Ca2+的調(diào)控以外，K+ 、Mg2+、CI-、H+也對(duì)頂體反應(yīng)起調(diào)控作用Ca2+內(nèi)流可導(dǎo)致H+外流，使精子內(nèi)部pH升高，誘發(fā)頂體反應(yīng)2)脂質(zhì)調(diào)控 脂質(zhì)在精子頂體反應(yīng)中調(diào)控膜的流動(dòng)性和“鈣泵”的活性。牛和豚鼠精獲能后，頂體外膜和精子質(zhì)膜上的溶血卵磷脂含量下降，而卵磷脂含量升高。卵磷脂是由溶血卵磷脂酸產(chǎn)生，并依賴于Ca

20、2+和磷脂酶A2作用產(chǎn)生溶血化合物，導(dǎo)致脂膜溶解，并發(fā)生胞吐作用。,,3)磷酸肌醇調(diào)控 多磷酸肌醇的產(chǎn)物是誘發(fā)頂體反應(yīng)的第二信使多磷酸肌醇在磷脂酶C (PLC)的作用下，產(chǎn) 生4,5 -磷酯酰肌醇二磷酸( PIP2 ) 。PIP2被PLC 水解，產(chǎn)生二酰甘油(DAG)和1,4,5一三磷酸肌醇( IP3 ) 在 IP3作用下，細(xì)胞內(nèi)非線粒體貯存的Ca 2+釋放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平提高，激活頂體反應(yīng)所需的關(guān)鍵酶；第二信使DAG，

21、它活化PKC，后者使蛋白磷酸化，誘導(dǎo)頂體反應(yīng),二. 皮層反應(yīng)(cortical reaction),精子與卵子接觸，卵就開始發(fā)生一系列深刻變化，為卵子激動(dòng)(activation), 首先是皮層變化, 即皮層反應(yīng). 此從精子入卵點(diǎn)開始，然后波及整個(gè)皮層.在精卵接觸點(diǎn)皮層顆粒首先破裂，內(nèi)含物（糖蛋白類）排出，一部分與卵外卵黃膜形成受精膜，其余保留在受精膜和卵之間的卵周隙中，吸水使受精膜舉起。受精膜形成和卵周隙出現(xiàn)可防止后到的精子進(jìn)入，防

22、止多精受精.,,,海膽和小鼠精子和卵子質(zhì)膜的融合,三. 多精受精的快阻斷,由卵膜的電變化引起，反應(yīng)快.海膽卵在海水中，細(xì)胞外具有特高的鈉離子, 細(xì)胞質(zhì)含有相對(duì)少的游離鈉，鉀離子情況正相反。靜止膜電位(resting membrane potential)為—70 mV.當(dāng)?shù)谝粋€(gè)精子結(jié)合后1-3秒，鈉離子內(nèi)流，膜電位變成+20 mV。此時(shí)精子再不能與卵子結(jié)合，阻斷第二次受精，此為多精受精的快阻斷。這種阻止多精受精過程短，且簡(jiǎn)短的電

23、位變化不足以最終阻止多精受精,四. 多精受精的慢阻斷,海膽多精受精快阻斷持續(xù)1分鐘。除去卵表面的多余精子，由皮質(zhì)顆粒反應(yīng)(cortical granule reaction)完成. 是一種慢的、機(jī)械的、在精卵接觸后1分鐘變活躍的反應(yīng)。海膽卵膜下面有15000個(gè)1μm的皮質(zhì)顆粒，內(nèi)含透明素、蛋白酶、過氧化物酶和粘多糖類。精子入卵處皮質(zhì)顆粒破裂，并向周圍擴(kuò)展引起更多皮質(zhì)顆粒破裂，釋放內(nèi)含物到卵質(zhì)膜和卵黃膜間，其間的蛋白質(zhì)被蛋白酶溶解。粘

24、多糖吸水使卵黃膜舉起成為受精膜(fertilization envolpe) .蛋白酶修飾或完全除去結(jié)合蛋白受體以及與其接觸的精子。過氧化物酶使受精膜變硬。同時(shí)卵內(nèi)儲(chǔ)存鈣釋放，鈣離子直接負(fù)責(zé)皮層反應(yīng)擴(kuò)展。完全防止多精受精.,第六節(jié) 遺傳物質(zhì)的融合,精與卵膜融合：精子核和中心粒與線粒體和鞭毛脫離并入卵，精子核解濃縮成雄原核(male pronucleus)。卵核變?yōu)閱伪扼w雌原核(female pronucleus).雄原核入卵后旋

25、轉(zhuǎn)180°，中心粒位于雌雄原核之間, 兩個(gè)原核彼此相向運(yùn)動(dòng)，融合形成二倍體的合子核。,,人類受精過程中雌雄原核的運(yùn)動(dòng),哺乳動(dòng)物雌雄原核在遺傳上被認(rèn)為是相等的，但研究提示在功能上可能不同(右下圖)。 如子宮瘤(水皰狀胎塊) 是單倍體精子受精缺少雌原核的卵形成的。同樣孤雌生殖或卵二倍體形成的胚胎具有脊髓、肌肉、骨骼和器官，包括跳動(dòng)的心臟。但在11-12天(小鼠妊娠期的一半)停止發(fā)育.,第七節(jié) 卵新陳代謝的激活,成熟卵在

26、代謝上是一個(gè)惰性的細(xì)胞，被精子入卵重新激活.啟動(dòng)一系列預(yù)定的代謝事件，如海膽：精卵結(jié)合 0秒受精卵電位升高 3秒以前精-卵膜融合 30秒以前第一次鈣離子增加 30秒皮質(zhì)泡的泡吐作用 30-60秒NAD酶激活 開始于1分鐘NA

27、DH和NADPH增加 開始于1分鐘精子進(jìn)入 1-2分鐘H+ 離子流出pH升高 1-5分鐘精子染色質(zhì)解濃縮 2-12分鐘精子核移向卵中央 2-12分鐘卵核移向精子核 5-10分鐘激活蛋白質(zhì)合成 開始于5-10分鐘激活氨基酸運(yùn)輸 開始于5-10分鐘起

28、始DNA合成 20-40分鐘有絲分裂 60-80分鐘第一次卵裂 85-90分鐘,,受精后卵內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)重排,倉(cāng)鼠的受精過程圖解,受精的條件和因素,1. 精子的活動(dòng)和受精力：精子缺乏細(xì)胞質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但卻很活躍 (人精每秒運(yùn)動(dòng)35-50μm；牛精120 μm/S；大鼠精70μm/S)，離體后生命較短暫(幾分鐘

29、-幾天)，即使有活動(dòng)能力(人精48-60小時(shí); 牛精96小時(shí); 大鼠精17小時(shí))，已喪失受精能力(人精和牛精保持24-48小時(shí)；大鼠精14小時(shí))。2. 精卵合適的成熟度。3. 精卵釋放物：精子和卵子釋放具有明顯效應(yīng)的物質(zhì)相互吸引，通常具種的特異性。卵子的卵黃膜和卵膜也相關(guān)。,4. 精子的數(shù)量：哺乳動(dòng)物行體內(nèi)單精受精, 每次射出的精子量極多，羊20-100億；牛40-100億；豬200-800億；人2-3億。但到達(dá)受精地點(diǎn)輸卵管的精