紅細胞檢驗的基礎

1、紅細胞檢驗的基礎理論,南昌大學一附院檢驗科 呂小林,紅細胞檢驗的基礎理論,紅細胞膜血紅蛋白紅細胞代謝紅細胞的衰老和死亡,紅細胞膜,一、紅細胞膜的組成與結構二、紅細胞膜的功能三、影響紅細胞膜穩(wěn)定的因素,細胞膜的化學組成,細胞膜,,膜脂,膜蛋白,,磷脂,膽固醇,,卵磷脂（磷脂酰膽堿）,腦磷脂（磷脂酰乙醇胺）,鞘脂（帶一個氨基）,糖脂（ABO血型）,,外周蛋白和整合蛋白,運輸蛋白、受體蛋白和酶,糖類,紅細胞膜脂質組成,,人紅細

2、胞膜的主要蛋白,,E.Gorter and F. Grendel Model, 1925,,結構,紅細胞膜結構示意圖,有關細胞膜結構的幾個,紅細胞膜骨架結構：膜下0.2ul膠溶層，包括主體蛋白和外周蛋白主體蛋白：鑲嵌于脂質雙層中，多屬糖蛋白外周蛋白：與脂質雙層疏松結合，易被水解血影（ghost）：RBC裂解釋放Hb后留下一個保留原形的空殼結構,,概念,細胞膜的化學結構,,,,外周蛋白,,膜骨架,主體蛋白,紅細胞膜蛋白結構示意圖,紅

3、細胞膜結構示意圖,,膜骨架功能,維持紅細胞的正常形態(tài)及變形性,膜結構最基本的特征,細胞膜的不對稱性細胞膜的流動性,細胞膜的不對稱性,膜脂的不對稱性膜蛋白的不對稱性（功能上的方向性不對稱）復合糖的不對稱性,細胞膜的不對稱性是生物膜完成復雜的在時間與空間上有序的各種生理功能的保證,膜脂質不對稱性,外小頁：PC（膽堿磷脂）、PM（鞘磷脂）內小頁：PE（乙醇胺磷脂）、PS（絲氨酸磷脂）與細胞老化、調亡、細胞識別和吞飲有關,膜蛋

4、白不對稱性,特性：具有明顯方向性和區(qū)域性蛋白激酶C 磷脂酰絲氨酸（內小頁）,,,復合糖不對稱性,特性：糖蛋白、糖脂僅分布于細胞外側意義：細胞表面受體、與細胞抗原性有關,細胞膜的不對稱性示意圖,膜流動性,主要指脂質和蛋白質的運動 脂質 液態(tài) 晶態(tài) 蛋白質 側向運動、旋轉運動生理意義：保證細胞生理功能必要條件,,,研

5、究膜蛋白流動性的經典實驗,,二、細胞膜的生物學功能,為細胞生命活動提供相對穩(wěn)定的環(huán)境選擇性的物質運輸，其中伴隨能量的傳遞提供細胞識別位點，完成信息傳遞提供多種酶結合位點，使酶促反應高效進行介導細胞與細胞、細胞與基質之間的連接參與形成具有不同功能的細胞表面特化結構,膜功能一、穩(wěn)定內環(huán)境,一、屏障作用二、賦予高度變性能力,膜功能二、物質跨膜運輸,簡單擴散協(xié)助擴散主動運輸（由ATP直接提供能量，如：鈉鉀泵和質子泵；間接由

6、ATP提供能量，如：協(xié)同運輸）基團轉移內吞和外排,,膜功能三、細胞識別及信息傳遞,細胞識別：與寡糖鏈密切相關1、血型抗原2、補體受體（CRI）,二、影響紅細胞膜穩(wěn)定因素,化學因素,影響膜穩(wěn)定和因素,免疫因素,紅細胞膜蛋白的遺傳性缺陷,酶代謝異常,ATP生成不足,,生物因素,,第二節(jié)血紅蛋白,血紅蛋白,血紅蛋白組成血紅蛋白結構、功能血紅蛋白種類影響血紅蛋白結構、功能因素,血紅蛋白組成,血紅素：鐵原子、原卟啉Ⅸ

7、珠蛋白,血紅蛋白,血紅蛋白結構與功能,結構：二條α鏈和二條β鏈 緊密型（T）、松弛型（R）功能：運輸氧，具有協(xié)同效應,生理性血紅蛋白種類,胚胎期：成人：,影響血紅蛋白結構和功能的因素,珠蛋白基因缺失或缺陷 Heinz酶缺陷 MHb化學藥物中毒 MHb、SHb、HbCO,第三節(jié) 紅細胞代謝,紅細胞糖代謝鐵代謝核苷酸代謝,紅細胞

8、糖代謝,葡萄糖無氧酵解磷酸戊糖途徑與谷胱甘肽途徑其它,葡萄糖無氧酵解,無氧酵解 獲取能量唯一途徑2、3二磷酸甘油酸代謝支路 影響血紅蛋白與氧親和力酶缺乏 丙酮酸激酶,磷酸戊糖途徑與谷胱甘肽途徑,磷酸戊糖途徑：還原性輔酶Ⅱ（NADPH）、磷酸核糖（參與嘌呤、ATP合成）谷胱甘肽途徑：保護-SH基團、降解H2O2酶缺乏：G6PD,鐵代謝 鐵的運轉,,鐵的貯存,紅細胞核苷酸代謝,維生素B12和葉酸的

9、來源與吸收轉運、利用與貯存在合成DNA中作用影響吸收和轉運因素,紅細胞核苷酸代謝,葉酸的吸收,葉酸,蝶酰單谷氨酸,四氫葉酸,雙氫葉酸還原酶,多谷氨酸鹽,參與DNA合成,組織細胞酶促作用下,,血漿,,,,,,,葉酸進入組織細胞后，轉變?yōu)槎喙劝彼猁}，才具有 參與DNA合成的活性。葉酸吸收障礙后2~7個月內導致葉酸缺乏，也引起與vitB12缺乏時相似的巨 幼紅細胞性貧血。 葉酸的活化需要vitB12參與，因此，vitB12缺乏時，

10、葉酸的利用率下降，可引起葉酸相對不足。,胃液,小腸上段,回腸,門脈血流,肝,轉鈷蛋白II造血組織,B12與R蛋白結合,胰蛋白酶斷裂結合。與內因子結合，免被蛋白水解酶破壞。,內因子一部分與B12結合，一部分與回腸上皮細胞膜特異受體結合，被吸收,,,,,,* 內因子胃腺壁細胞分泌的一種糖蛋白 R蛋白是一種電泳速度很快的血漿蛋白。** B12吸收障礙，巨幼RBC性貧血---大細胞性貧血,Vit.B12吸收,紅細胞的衰老

11、和死亡,1、紅細胞糖代謝改變2、紅細胞膜及血紅蛋白改變,3、紅細胞的破壞,紅細胞平均壽命120天，在血管內循環(huán)流動約27KM，在穿過小血管和孔隙時可變形而不至于破裂。衰老紅細胞脆性增加，易破裂，通過微小孔隙也發(fā)生困難，容易停滯于脾和骨髓中被巨噬細胞所吞噬。,細胞的衰老：,未分化,,分化,,衰老,,死亡,衰老是一種正常的生命現(xiàn)象,生物體內的絕大多數細胞，都有經過未分化、分化、衰老、死亡這幾個階段。,紅細胞的死亡,紅細胞的消亡無效

12、造血,紅細胞檢驗的基本方法,一附院 呂小林,紅細胞檢驗的基本方法,有關鐵指標的檢驗血清和紅細胞葉酸測定溶血的檢驗紅細胞膜缺陷的檢驗紅細胞酶缺陷的檢驗血紅蛋白異常的檢驗免疫性溶血貧血的檢驗,血清鐵測定,原理：Fe2+ Fe +3 +顯色劑，生成有色絡合物。應用評價1、降低：需求量增加、IDA、慢性失血和 感染等。2、增高：肝疾病、鐵粒幼

13、細胞貧血、AA、 慢性溶血、反復輸血等3、血清經常變化，單項檢測意義不大。,,血清鐵蛋白測定,原理：固相放射免疫法。兔抗人鐵蛋白+血清鐵蛋白 Ag-Ab復合物+125I標記Ab 標記Ab-Ag-Ab，檢測復合物中放射性 算出血清鐵蛋白值應用：能準確反映體內儲鐵情況。SF減少是診斷IDA敏感方法之一。1、降

14、低：IDA、慢性失血和 貧血等。 2、增高：肝疾病、鐵代謝障礙性貧血、感染、 惡性腫瘤等,,,血清總鐵結合力測定,原理：在血清中加入已知過量的鐵標準液，使之飽和，并檢測其中鐵，即總鐵結合力。再減去原血清轉鐵蛋白中所含的鐵，為未飽和鐵結合力應用：增高 IDA和真紅細胞增多癥等。 降低或正常 肝疾病、溶血性貧

15、 血、感染、惡性腫瘤和腎病綜合征等,,小細胞低色素性貧血的實驗鑒別,鐵檢驗,鐵檢驗,IDA紅細胞掃描電鏡圖像：,,缺鐵性貧血血象：,,IDA紅細胞形態(tài),IDA紅細胞,正常紅細胞,IDA骨髓病理 正常骨髓外鐵外鐵（-）~（±）： （+）~（++）：,,細胞內鐵,,第二節(jié) 葉酸和維生素B12的檢測,一、葉酸測定 放射免疫法二、維生素B12測定 放

16、射免疫法三、應用評價 1、降低：巨幼細胞貧血 2、增高：白血病，某些惡性腫瘤等,巨幼細胞貧血血象,,巨幼細胞貧血骨髓象,,巨幼細胞貧血骨髓象,,第三節(jié)溶血的檢驗,紅細胞壽命測定血漿游離血紅蛋白檢測血清結合珠蛋白檢測尿含鐵血黃素檢驗,實驗室檢查,一、RBC壽命測定（最佳） 51Cr同位素標記正常值：25~32天應用評價 1、溶血性貧血 紅細胞壽命縮短，約14天 2、再生障礙性貧血 約15-29天,紅細

17、胞碎片,,血漿游離血紅蛋白檢測,原理 利用HB具有過氧化物酶活性，采用過氧化物酶法檢測血漿游離血紅蛋白。參考值 0-40mg/L臨床評價 1、判斷血管內溶血 PNH、蠶豆病、溶血反應等明顯增高，自身免疫性貧血、珠蛋白障礙性貧血可輕到中度增高。 2、血管外溶血不增高,溶血的檢驗,血清結合珠蛋白檢測,原理 血清結合珠蛋白測定是在待測血清中加入一定量的血紅蛋白液，使之與測血清中的HP形成HP-HB復合物。通過電泳

18、法分離復合物，并測定其量，從而算出結合珠蛋白的量。參考值 0.5-1.5gHB/L臨床評價 1、減低 常見于各種溶血， 尤其血管內溶血 2、增高 感染、創(chuàng)傷、惡性腫瘤等,溶血的檢驗,尿含鐵血黃素檢驗,原理 當血紅蛋白通過腎濾過時,部分鐵離子以含鐵血黃素的形式沉積于上皮細胞,并隨尿排出.上皮細胞中高鐵離子與亞鐵氰化鉀作用,在酸性環(huán)境下產生藍色沉淀.參考值 陰性臨床評價 慢性血管內溶血,溶血的檢驗,Hp與Rous

19、異同點,相同點：都反應血管內溶血不同點：,紅細胞膜缺陷的檢驗,原理 檢測紅細胞對不同濃度低滲鹽溶液的抵抗力.紅細胞在低滲鹽溶液中,當水滲透其內部達一定程度時,紅細胞發(fā)生膨脹破裂.參考值 開始溶血:4.4-4.8G/L 完全溶血:2.8-3.2G/L臨床評價:脆性增加 球形紅細胞/橢圓形紅細胞增多癥;脆性降低 珠蛋白合成障礙等.,,,,,0.32,0.30,0.22,NaCl,,,,,,,,,0.

20、28,0.26,0.24,0.36,0.34,,完全溶血 開始溶血 未溶血,,成熟紅細胞,,淚滴狀紅細胞,,鐮狀紅細胞,缺鐵性紅細胞,,二、自身溶血試驗及糾正試驗 正常孵育48小時 0.2-4.0%,加糖 0.1- 0.6%,加ATP 0.1-0.8%。遺傳性球形紅細胞增多癥者，ATP、糖均能糾正；G6PD缺乏者，糖糾正；丙酮酸激酶缺乏者，ATP糾正。三、紅細

21、胞膜三磷酸腺苷活性測定四、酸化甘油溶血試驗五、高滲冷溶血試驗六、紅細胞膜蛋白電泳分析,紅細胞酶缺陷的檢驗,原理 在血液中加入亞硝酸鹽使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白,正常紅細胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP變成NADPH,使高鐵血紅蛋白還原成亞血紅素,通過比色沒其濃度.參考值 >75%臨床評價 G-6-PD酶缺乏患者。中間缺乏者為31-74%。嚴重缺乏者<30%,（3） 高鐵血紅蛋白還原試驗

22、 （methemoglobin reduction test）正常值：定性法（－） 半定量法 還原率>75% G6PD缺陷—定性（＋），半定量<70%。 　 G6PD 高鐵血紅蛋白還原酶G6P NADP 還原型美蘭 HbFe3+6PG

23、 NADPH 氧化型美蘭 HbFe2+ NaNO2,,,,,,,,,,,紅細胞酶缺陷檢驗,二、變性珠蛋白小體生成試驗三、G6PD熒光斑點試驗和活性測定四、PK熒光斑點試驗和活性測定五、谷胱甘肽還原酶缺陷檢測,NADP+,NADPH（紫外線下發(fā)熒光）,,G6PD,PEP,,丙酮酸,,乳酸,PK,LDH,,ADP,ATP,,NADH,NAD+,血紅蛋白異常的檢驗,原理 根

24、據不同的血紅蛋白帶有不同的電荷,等電點不同,在一定的PH緩沖液中,其所帶電荷不同,在電場中泳動速度不同,根據此特點將它們區(qū)分開.參考值 HBA>95% HBF<2% HBA2為1.0-3.0%臨床評價 HBA2增多見于ß珠蛋白生成障礙性貧血;HBF見于不穩(wěn)定血紅蛋白增多.,（2）血紅蛋白電泳分析,主要檢查有無異常Hb區(qū)帶在HbA前出現(xiàn)——快速異常：HbH，J，K組在HbA后出現(xiàn)——慢速異常：HbG，

25、D，E組,,,異常HB帶,+,—,（2） 變性珠蛋白小體生成試驗,受檢RBC＋乙酰苯肼 作活體染色（甲基紫） 37℃1~2h 有變性珠蛋白小體，則膜上形成紫黑色顆粒結果：含5個以上者即（＋） ，正常人<30%意義：不穩(wěn)定Hb也可出現(xiàn)，故僅作篩選,,變性珠蛋白小體,血紅蛋白異常檢驗,二、聚丙

26、烯酰胺凝膠電泳檢測三、抗堿血紅蛋白檢測四、異丙醇沉淀試驗五、熱變性試驗,第七節(jié) PNH檢驗,一、酸化血清溶血試驗原理：患者體內存在對補體敏感紅細胞，即紅細胞在酸性（PH6.4-6.5）的正常血清中孵育，補體被激活，而產生溶血。參考范圍：陰性應用評價：主要見于PNH患者,（一）酸溶血試驗（Ham`s test） 特異性高，是國內外公認的PNH確診試驗,PNH檢驗,二、蔗糖溶血試驗 特異性敏感性均不如Ham`s，僅做篩選。

27、三、蛇毒因子溶血試驗（復合蛇毒） 敏感性，靈敏度高于Ham`s，特異性不如Ham`s 。,一、抗人球蛋白試驗,原理 直接試驗應用抗人球蛋白試劑與紅細胞表面的IgG分子結合,如紅細胞表面存在自身抗體,出現(xiàn)凝集反應.參考值 陰性臨床評價 自身免疫性貧血,免疫性溶血貧血的檢驗,第八 免疫性溶血性貧血檢驗,四、篩選試驗,(一)抗人球蛋白試驗（Coombs` test） 1. 直接抗人球蛋白試驗（DAGT） 測RBC表面結合的