PKC誘導紅細胞錨蛋白外翻誘發(fā)的巨噬細胞噬紅細胞作用.pdf

1、人紅細胞的平均壽命為100~120天，正常人體內(nèi)大約存在3×1013個紅細胞。每天，有超過2×1011個紅細胞被替換。紅細胞在體內(nèi)經(jīng)歷成熟、衰老，最終被脾、肝、骨髓等處的巨噬細胞吞噬、分解。而且老化或者疾病的紅細胞往往呈現(xiàn)較弱的細胞形變以及形變恢復能力，使之易于被脾臟滯留，從而被吞噬細胞吞噬以及消化。巨噬細胞對凋亡細胞的識別主要通過其表面的受體來進行的。成熟哺乳動物的紅細胞沒有細胞核以及細胞器等，紅細胞膜的異常（如帶3蛋白交聯(lián)，錨蛋白外

2、翻）觸發(fā)了巨噬細胞表面的受體分子與其識別，接著黏附、吞噬和分解。然而，膜蛋白的異常導致的紅細胞過早清除或者凋亡障礙與多種血液疾病相關(guān)，如膜蛋白缺陷、阿爾茨海默癥以及高原紅細胞增多癥。同樣在血液保存中，膜蛋白的異常與否往往與血液保存時間的長短有關(guān)。探其根源，紅細胞膜蛋白的異常以及紅細胞程序性死亡與紅細胞胞內(nèi)的PKC激活密切相關(guān)。因此，本文通過PMA激活紅細胞胞內(nèi)的PKC，從而探討激活的PKC與紅細胞錨蛋白外翻的關(guān)系以及誘導紅細胞錨蛋白外翻

3、的機制問題，也進一步探索了激活的PKC誘導紅細胞膜骨架結(jié)合親和力的變化與紅細胞形變能力的相關(guān)關(guān)系。希望為深入了解紅細胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)以及治療膜蛋白異常的相關(guān)血液疾病，同時也對研究人工紅細胞的膜骨架蛋白與紅細胞變形性能、血液保存過程中血液保存時間的延長等提供細胞和分子層面的探索機理。
　　紅細胞錨蛋白為膜內(nèi)在蛋白，只有當錨蛋白外翻到細胞膜的外側(cè)且錨蛋白RGD序列端也暴露在細胞表面時，巨噬細胞表面的受體分子整合素αvβ3才能與之識別、黏

4、附和吞噬。本研究論文通過PMA激活紅細胞胞內(nèi)的PKC來判斷與紅細胞程序性死亡緊密相關(guān)的胞內(nèi)PKC的激活能否誘導紅細胞錨蛋白的外翻。結(jié)果表明，激活的PKC能夠誘導紅細胞錨蛋白外翻到紅細胞膜外側(cè)，然而錨蛋白外翻的紅細胞的比例呈PMA濃度依賴關(guān)系，而且錨蛋白外翻的紅細胞的比例體現(xiàn)出血液捐獻者的個體差異性。這意味著盡管PMA誘導PKC的激活能夠促使紅細胞錨蛋白的外翻，但是錨蛋白外翻的紅細胞的比例與胞內(nèi)游離的PKC對PMA的敏感性以及紅細胞胞內(nèi)P

5、KC活性的異質(zhì)性有關(guān)。為了探討外翻的錨蛋白與整合素αvβ3的結(jié)合能否介導巨噬細胞與紅細胞的黏附，本文通過對巨噬細胞黏附紅細胞的檢測以及封閉整合素αvβ3（封閉膜上的結(jié)合位點）和錨蛋白（封閉巨噬細胞表面的結(jié)合位點）的結(jié)合位點分析。結(jié)果表明，錨蛋白的外翻能誘發(fā)巨噬細胞的噬紅細胞作用，結(jié)合位點的封閉能明顯降低巨噬細胞對紅細胞的黏附數(shù)量。
　　紅細胞程序性死亡往往起始于細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。提高的胞內(nèi)鈣離子濃度能夠激活半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶

6、以及鈣依賴的酶，從而降解細胞骨架及分解蛋白質(zhì)，導致細胞囊泡化等，最終細胞調(diào)亡。PKC是一種鈣離子依賴的酶，激活的PKC能夠誘導細胞胞外鈣離子的快速流入，促使其胞內(nèi)鈣離子水平的升高。同時激活的PKC也能誘導紅細胞膜蛋白的磷酸化，從而導致紅細胞膜骨架結(jié)合親和力的減弱。因此，本文運用PKC的抑制劑Calphostin C（封閉PKC的激活位點）和Chelerythrine chloride（競爭性抑制激活的PKC的磷酸化作用位點）來分析鈣離子

7、以及錨蛋白的磷酸化與紅細胞錨蛋白外翻的關(guān)系。結(jié)果表明，激活的PKC誘導細胞胞外鈣離子的流入以及錨蛋白的磷酸化作用共同促使紅細胞錨蛋白的外翻。此外，研究也表明僅僅是胞內(nèi)鈣離子水平的增加或者僅僅錨蛋白的磷酸化作用均不足以誘導紅細胞錨蛋白的外翻。
　　為了進一步探討激活的PKC與紅細胞錨蛋白外翻的關(guān)系。本文通過不連續(xù)密度梯度離心法分離出老紅的紅細胞層，檢測其錨蛋白外翻、胞內(nèi)鈣離子以及錨蛋白磷酸化水平的情況。也檢測了PMA誘導不同密度層紅

8、細胞的上述指標變化情況。結(jié)果表明，在老化層中有一定數(shù)目的紅細胞呈現(xiàn)其錨蛋白的外翻。同時PMA對不同密度層紅細胞的錨蛋白外翻以及胞內(nèi)鈣離子有不同的影響（對不同密度層紅細胞錨蛋白的磷酸化水平影響卻不大）。這意味著在老化的紅細胞中存在著紅細胞程序性死亡的信號分子—錨蛋白外翻，同時也進一步確認了誘發(fā)紅細胞錨蛋白外翻的兩個必不可必少的條件（胞內(nèi)鈣離子水平的增加以及紅細胞錨蛋白的磷酸化作用）。
　　本論文還檢測了PKC誘導的錨蛋白外翻對紅細胞

9、變形性能的影響，以及PKC誘導的膜蛋白磷酸化作用導致膜骨架結(jié)合親和力的改變與紅細胞形變能力的變化關(guān)系。結(jié)果顯示，錨蛋白的外翻能夠引起紅細胞變形性能的減弱，錨蛋白的磷酸化作用引起的紅細胞膜骨架結(jié)合親和力的改變與紅細胞變形指數(shù)的變化關(guān)系不大，而蛋白4.1的磷酸化作用誘導的紅細胞膜骨架結(jié)合親和力的改變在紅細胞形變能力的變化關(guān)系中有著重要的作用。因此，錨蛋白的外翻以及膜骨架結(jié)合親和力的減少誘導的紅細胞形變能力的減弱進一步促進了巨噬細胞對該紅細胞