腫瘤免疫治療臨床應(yīng)用及進展

1、腫瘤免疫治療臨床應(yīng)用及進展 --《腫瘤生物治療學基礎(chǔ)與臨床》,,教學目的與要求,熟悉腫瘤免疫治療的策略和方法認識免疫治療在腫瘤綜合治療中的地位和作用了解腫瘤免疫治療的最新進展,一、腫瘤的免疫治療,基本原理： 提高腫瘤抗原免疫原性，激發(fā)和增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答，提高腫瘤對抗瘤免疫效應(yīng)的敏感性，在體內(nèi)外誘生腫瘤特異性效應(yīng)細胞和分子等。 抗腫瘤免疫治療包括主動免疫治療、被動免疫治療。,1、干擾素1）I

2、型干擾素：由單核巨噬細胞、病毒誘導的成纖維細胞、轉(zhuǎn)化的B細胞產(chǎn)生 種類：IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε等 作用：抑制腫瘤細胞周期、誘導細胞凋亡 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng) 感染腫瘤血管生成 其它作用：抗病毒2）II型干擾素：由活化的T細胞、原始的Th0細胞和NK細胞產(chǎn)生 種類：IFN-γ 作用: 激活巨噬細胞、NK細胞等直接殺傷癌細胞 延長細胞周期、抑

3、制腫瘤細胞的生長和增殖 促進MHC-I、II類分子和抗原遞呈細胞尚共刺激分子的表達 在干擾素的調(diào)節(jié)下，IFN-γ可誘導Th0向Th1分化，抑制向Th2分化，增強細胞免疫和CTL的殺傷活性臨床藥物：基因工程產(chǎn)品，已國產(chǎn)化。 干擾靈、賽若金 、因特芬、派羅欣。。。。。,（一）細胞因子治療,,適應(yīng)癥：干擾素主要用于治療晚期毛細胞白血病、腎癌、黑色素瘤、kaposi肉瘤、慢性粒細胞性白血病和中低度惡性非霍奇金淋巴瘤

4、，其他曾用于骨肉瘤、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、頭頸部癌和膀胱癌等。對慢性乙、丙型肝炎也有效。用法：第1周300萬單位，皮下注射，每周2～3次， 第2周每次加到500～600萬單位，第3周加到900～1000萬單位連續(xù)6周，共8周為1療程。 干擾素亦可局部注射（瘤周浸潤）、腔內(nèi)注射（癌性胸腹腔積液）或膀胱內(nèi)灌注。毒副作用：高劑量干擾素具有一般生物制劑的反應(yīng)即發(fā)熱、流感樣癥狀，肌肉酸痛等，其次是輕度骨髓抑制。一般對肝腎功

5、能無影響，少數(shù)有轉(zhuǎn)氨酶、血肌酐升高。,,2、白細胞介素-2 （IL-2)來源：主要由激活的T淋巴細胞分泌和表達，此外NK、轉(zhuǎn)化的B細胞和LAK細胞也可產(chǎn)生 作用：①促進T細胞增殖及相應(yīng)的細胞因子分泌 ②刺激NK生長并增強其殺細胞活性 ③誘導LAK、NK、TIL擴增及細胞因子的分泌 ④促進B細胞分化、增殖和產(chǎn)生抗體 ⑤參與機體的炎癥反應(yīng)、抗腫瘤免疫反應(yīng)和移植排斥反應(yīng)臨床藥物：基

6、因工程IL-2 欣吉爾、德路生 、遠策欣 。。。。,,適應(yīng)癥：用于腎細胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、直腸癌、淋巴瘤、肺癌等惡性腫瘤的治療。用于癌性胸腹水的控制。用于手術(shù)后、放療及化療后的腫瘤治療，可增強機體免疫功能。也用于自身免疫性疾病和病毒性、細菌性疾病的治療，如乙肝、結(jié)核病。用法：1）胸腹腔注射 100-200萬IU/次，每周1-2次，2-4周為一療程。 2）局部注射 根據(jù)癌灶大小決定劑量，每次每個

7、病灶不少于610萬IU，隔日1次，4周為一療程。 3）皮下注射 60-100萬IU/m3，每日1次，每周5次，4周為一療程。 4）靜脈滴注 40-80萬IUIU/m3，每日1次，緩慢滴注，每周5次，4周為一療程。,,毒副作用：治療中常見副反應(yīng)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、乏力、惡心、輕度食欲下降等。其他少見的副反應(yīng)包括局部反應(yīng)、皮疹、血壓下降、水潴留、轉(zhuǎn)氨酶升高等。 這些副反應(yīng)多為輕度、易耐受，停藥后可自行緩解。

8、必要時可給與消炎痛或給予升壓等措施對癥處理。,,3、IL-12 主要是由抗原呈遞細胞（如單核巨噬細胞、樹突細胞及B淋巴細胞產(chǎn)生） 作用：①誘導Th0分化為Th1，增強細胞免疫應(yīng)答 ②促進NK、T細胞增殖，誘導LAK、TIL產(chǎn)生， 并增強上述細胞的殺傷功能 ③誘導Th1、NK分泌IFN-γ ④促進巨噬細胞分泌一氧化氮，殺傷腫瘤細胞 ⑤抑制腫瘤血管的生

9、成 ⑥增強腫瘤細胞表達MHC-I II類分子，提高腫 瘤細胞對免疫效應(yīng)細胞的易感性 ⑦增加抗原遞呈細胞對腫瘤抗原的遞呈功能,,動物試驗： 應(yīng)用基因工程技術(shù)，將IL-12基因?qū)肽[瘤細胞、樹突細胞、成纖維細胞等，制成腫瘤疫苗，使IL-12在局部分泌，誘發(fā)機體的抗腫瘤免疫。臨床試驗： 重組人(rHu)IL-12治療慢性乙型肝炎，效應(yīng)與劑量相關(guān)，但較大劑量較易有不良反應(yīng)

10、， IL-12能恢復由實體瘤轉(zhuǎn)移患者PBMC獲得的NK細胞活性， IL－12還能增強毛細胞白血病患者NK細胞活性， IL-12抗腫瘤作用,,4、IL-4主要由活化的T淋巴細胞（特別是Th2細胞）產(chǎn)生。作用：⑴促進休止期的B細胞活化，促進B細胞分泌IgE，增加B細胞的抗原遞呈功能，促進體液免疫應(yīng)答。 ⑵維持胸腺細胞和活化T細胞的生長，誘導Th2產(chǎn)生，抑 制Th1分泌細胞因子。 ⑶

11、誘導NK細胞增殖。 ⑷激活巨噬細胞，促進其抗原遞呈和殺傷腫瘤細胞的作用。 ⑸誘導外周血單個核細胞分泌M-CSF和G-CSF，增強中性粒細胞介導的吞噬、殺傷功能和抗體依賴性細胞介導的細胞毒效應(yīng)（ADCC）應(yīng)用：主要用于DC細胞的誘導、擴增。,,5、腫瘤壞死因子TNF1）TNF-α：主要來源于LPS、細菌DNA等抗原分子激活的單核巨噬細胞、其它細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞等產(chǎn)生的。 作用：① 影響免疫反應(yīng)過程

12、 ② 影響非免疫細胞 ③ 促進細胞因子分泌 ④ 調(diào)控細胞凋亡 ⑤ 全身反應(yīng)2）TNF-β：主要由Th1、CD8＋T細胞和早期的B細胞產(chǎn)生作用：是炎癥過程的重要組成成分,,6、集落刺激因子 是一種低分子量糖蛋白，能夠在體內(nèi)外選擇性刺激造血干細胞增生、分化成某一譜系的細胞分類：G-CSF,M-CSF, GM-CSF, IL-3, EPO, SCF,,7、胸腺素

13、分為αβ兩族 作用：1）具有免疫增強作用，可促進T細 胞、NK、LAK等細胞的增殖及殺傷 活性 2）參與細胞骨架的形成，通過對 肌動蛋白的調(diào)節(jié)，參與某些腫瘤的 轉(zhuǎn)移,（二）腫瘤的主動免疫治療,應(yīng)用腫瘤抗原或模擬腫瘤抗原的疫苗刺激機體免疫系統(tǒng)，激發(fā)或增強機體的抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答，阻止腫瘤生長、擴散和復發(fā)。,腫瘤疫苗,腫

14、瘤疫苗與傳統(tǒng)疫苗在概念上不同，它主要不是用于腫瘤的預防，而是通過瘤苗的接種來刺激機體對腫瘤的免疫應(yīng)答來治療腫瘤。 該法應(yīng)用的前提是腫瘤抗原能刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 對手術(shù)后清除微小轉(zhuǎn)移瘤灶和隱匿瘤、預防腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)有較好的效果。,1、腫瘤細胞疫苗,即通過自體腫瘤細胞粗提取物，經(jīng)物理化學或生物手段處理后抑制其生長能力，保持其免疫原性，需加入佐劑如卡介苗等以增強免疫原性。,,,,2、腫瘤基因工程疫苗,腫瘤基因工程疫苗通過

15、基因重組技術(shù)，將目的基因?qū)胧荏w細胞而制備的疫苗。,2、腫瘤基因工程疫苗,1)、提高機體抗腫瘤能力,將外源基因?qū)朊庖呒毎浔磉_產(chǎn)物作用于免疫細胞，促進免疫細胞生長、分化，從而提高機體的抗腫瘤能力。 目前研究較多的是細胞因子基因的轉(zhuǎn)導，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ以及GM-CSF等。 實驗顯示，在各種細胞因子中，以GM－CSF基因修飾的腫瘤細胞疫苗效果最好，這與其誘導

16、DC成熟有關(guān)。,2)、增強腫瘤免疫原性,通過表達腫瘤所缺乏的某些分子，以增強其免疫原性。如將B7基因?qū)刖哂心[瘤抗原的腫瘤細胞，不僅能恢復腫瘤特異性免疫反應(yīng)，也可增強IL-2的抗瘤活性。一些腫瘤相關(guān)抗原（TAA）基因的轉(zhuǎn)導研究，顯示也可以增強其免疫原性，如CEA、AFP、gp100、MART-1。,3)、基因產(chǎn)物直接殺傷瘤細胞,如TNF基因?qū)肽[瘤細胞可使局部持續(xù)分泌TNF、從而直接殺傷腫瘤細胞。,3、肽疫苗,8-10個氨基酸的多肽是T

17、細胞識別的基礎(chǔ)肽疫苗主要包括以下二種：1）、癌基因、抑癌基因突變肽疫苗 目前已合成的p21-K-Ras-125突變肽、EGFRvIII突變肽和Her2/neu肽等。2）、病毒相關(guān)疫苗 如EB病毒與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤，HBV與肝癌，人類T細胞白血病病毒與成人T細胞白血病。,Oncophage® (Vitespen),通過加工、純化自體腫瘤細胞的gp96等熱休克蛋白HSP，獲得大量腫瘤抗原。一項III 期臨床

18、研究中728 腎癌術(shù)后隨機分為觀察組和治療組結(jié)果： 復發(fā)率 觀察組 治療組 P值 全部 27.3% 25.0% 0.384 I+ II期

19、 27.0% 15.2% 0.056 III +IV 27.5% 32.0% 0.686 中危患者* 30.9% 16.3% 0.004 中

20、?；颊?:I/II期低分化/III期高分化 俄羅斯2008-4-9批準Oncophage 用于中危腎癌的輔助治療。 Lancet. 2008 (9633):145,4、核酸疫苗,核酸疫苗是由能引起保護性免疫反應(yīng)的抗原基因片段及其載體構(gòu)建而成。 包括DNA疫苗和RNA疫苗。,4、

21、核酸疫苗,5、抗獨特型抗體疫苗,腫瘤抗原可誘導抗體(Ab1)產(chǎn)生，該抗體可變區(qū)的獨特型決定簇具有免疫源性，可誘導抗體Ab2產(chǎn)生，稱為抗獨特性抗體。也是一種抗抗體。 在這些Ab2中，有的可模擬原來的抗原結(jié)構(gòu)誘導抗原的特異性免疫反應(yīng)，可作為腫瘤疫苗應(yīng)用。,這種疫苗的特點是，它既不是天然抗原的本身，也不是人工合成的抗原自身，而是抗原本身的“摸擬物”，當用這種疫苗接種時，機體雖然沒有直接接觸抗原，卻能產(chǎn)生對相應(yīng)抗原的免疫應(yīng)答 具

22、有抗原放大效應(yīng),,已進入Ⅱ、Ⅲ期臨床的抗獨特型抗體：卵巢癌相關(guān)抗原CA125的獨特型疫苗：AcA125黑色素瘤的獨特性疫苗：BEC2、TriGem等淋巴瘤的獨特性疫苗：Id-KLH乳腺癌的獨特性疫苗：1E10結(jié)直腸癌的獨特性疫苗：105AD7,6、樹突狀細胞（DC）疫苗,腫瘤抗原屬于內(nèi)源性抗原，機體主要依靠CTL免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細胞。但腫瘤細胞表面的MHC-抗原肽段復合物表達水平低，需要經(jīng)體內(nèi)抗原提呈細胞加工、處理，提供誘導

23、T細胞活化的第二信號，才能激發(fā)腫瘤特異性CTL的產(chǎn)生。由于DC在誘導體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答中的重要功能，目前認為，DC在啟動抗腫瘤免疫的抗原呈遞中發(fā)揮重要作用。,Dendritic cells connect innate immunity and adaptive immunity,人DC至少有三條來自于不同前體細胞的發(fā)育途徑：1）CD34+細胞分化為DC2）外周血單核細胞分化為DC3）淋巴樣DC前體細胞分化途徑

24、,,臨床應(yīng)用—治療惡性淋巴瘤,腫瘤抗原可以基因、多肽、蛋白、甚至完整細胞的形式負荷給DC，因此DC疫苗的制備明顯比基因修飾的腫瘤細胞疫苗容易，因而促進了DC疫苗進入臨床試驗。 1996美國斯坦福大學的Hsu等首先采用抗獨特型抗體負荷的DC疫苗治療了4例B細胞型淋巴瘤，3例獲部分緩解。,抗原沖擊DC治療乳腺癌（I/II期臨床）,病人： 高表達HER2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人16例方法： HER500沖擊的自體APC 2

25、5;108 to 5×109 ， 二周一次，共三次。 副作用：主要為寒戰(zhàn)和發(fā)熱，沒有3-4級的毒副反應(yīng)結(jié)果： 12個可評價的病人，1例PR 結(jié)論： HER500沖擊的自體DC使用安全，有一定 療效，但效率仍不夠高。 J. W. Kylstra, et al. ASCO 2003,治療轉(zhuǎn)移性腎癌（I/II期臨床）,病人：轉(zhuǎn)移性腎癌 15例方法：腫瘤細胞溶解物沖擊的DC 3.9

26、5×106 淋巴結(jié)內(nèi)注射副作用：無明顯的毒副作用結(jié)果：7例進展，7例穩(wěn)定，1例部分退縮 (14.4×106細胞 )結(jié)論：腫瘤細胞溶解物沖擊的DC，即使在有大負荷腫瘤時也有效，在大劑量使用時更有效，無毒副作用。 Marten A, et al. Cancer Immunol Immunother. 2002,PROVENGE® (sipuleucel-T),Pro

27、venge是PA2024 (GM-CSF和PAP的融合蛋白)與自身樹突狀細胞孵育后獲得的自體DC細胞疫苗。 III期研究設(shè)計:127例無癥狀激素治療無效的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者，以2:1比例接受sipuleucel-T (2周1次，連續(xù)3次) 或安慰劑治療，3月后曲線分離。

28、 J Clin Oncol.2006:3089,DC Vax-Brain,患者DC細胞經(jīng)自體腫瘤細胞刺激后獲得。膠質(zhì)瘤手術(shù)聯(lián)合放化療的MS為14.6個月，TTP為6.9個月。 N Engl J Med, 2005:987I期和I/II期研究中發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)

29、瘤經(jīng)DCVax-Brain治療后（皮下注射）后，3年存活率為53%，95%的患者MS超過14.6個月，TTP超過6.9個月。http://www.cancernetwork.com/publications/oncology/archives基于上述研究結(jié)果，瑞士批準該疫苗上市。目前II期臨床研究正在進行中。,,由于大多數(shù)腫瘤抗原 未被識別，因此腫瘤細胞溶解物負荷的DC疫苗可使更多的患者接受此種方法治療。 直接攜帶腫瘤抗

30、原的DC作用更為直接，可以活化靜息的T細胞，誘導強烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。,（三）腫瘤的被動免疫治療,1、單克隆抗體靶向治療 又稱之為生物導彈技術(shù)，通過補體系統(tǒng)和自然殺傷細胞起抗腫瘤作用。,嵌合型單抗達到95％以上人源化,減少了異種免疫原性。,,1） 抗腫瘤單克隆抗體直接體內(nèi)應(yīng)用 很多進入臨床治療試驗，包括抗白細胞 分化抗原CD19、CD20、CD22、CD33，表皮生長因子受體（EGFR），MU C－1，前列腺特異性

31、抗原（PSA），前列腺特異性膜抗原（PSMA），癌基因c－erbB2產(chǎn)物，神經(jīng)節(jié)苷酯GD3、GM2等抗原的單抗。,,2） 抗腫瘤單克隆抗體與抗腫瘤藥物、生物毒素、細胞因子或放射性核素偶聯(lián)： 生物毒素，如假單胞菌毒素或蓖麻毒素； 放射線同位素，如131I 、186Re、177Lu、90Y、212Bi、67Cu、等 單抗作為導向物可增加毒素、放射性同位素等在腫瘤局部 的濃度，增加對腫瘤的殺傷力或誘導腫瘤局部的免疫反應(yīng)。,,

32、3）基因工程抗體-毒素（或酶）融合蛋白直接殺瘤 4）抗腫瘤單克隆抗體和抗效應(yīng)細胞表面分子的抗體組成雙特異性抗體，可引導殺瘤效應(yīng)細胞向腫瘤灶集中 5)胞內(nèi)抗體在腫瘤細胞內(nèi)表達，特異性作用于致瘤的癌基因產(chǎn)物或端粒酶,,2、腫瘤過繼性免疫治療 向腫瘤患者體內(nèi)輸注具有抗瘤活性的免疫細胞，直接殺傷腫瘤細胞或激發(fā)機體抗腫瘤免疫效應(yīng)。 回輸?shù)男?yīng)細胞包括：在體外用腫瘤抗原或淋巴因子激活的淋巴細胞（CIK、TIL等

33、）、導入外援細胞因子基因并表達相應(yīng)產(chǎn)物的淋巴細胞等。,11)LAK細胞,LAK細胞是在1980年由美國國立癌癥研究所Rosenberg發(fā)現(xiàn)，并在1982年由Grimm等命名的。這是一類由IL-2激活的能夠殺傷NK抵抗的新型免疫細胞，是一種強烈的，廣譜的，具有殺瘤活性的細胞。隨后臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤等疾病治療。但由于LAK細胞活性的維持需要IL-2，而IL-2副作用大，而且在以后的臨床總結(jié)中發(fā)現(xiàn)LAK細胞療效較低，現(xiàn)已基本不用。,2)CD

34、3AK細胞,是在LAK細胞基礎(chǔ)上，用抗CD3單抗和IL-2聯(lián)合誘導的殺瘤細胞。由于使用了抗CD3單抗刺激，減少了IL-2的用量，降低LAK治療的毒副作用，且CD3AK的抗腫瘤活性大大高于LAK細胞。 對晚期惡性腫瘤患者輸注自體 CD3AK 細胞 1個療程后 ,實體瘤組治療有效率為 25. 45%,臨床獲益率為 74. 54%;淋巴瘤組有效率為 83. 33%,臨床獲益率為 91. 67%。,,在利用外周血淋巴細胞制備免疫效

35、應(yīng)細胞的研究中，為增加效應(yīng)細胞的數(shù)量和殺瘤活性，常添加一些激活劑如抗CD3單抗，植物血凝素PHA等，以提高免疫治療療效。 實驗顯示PHA預刺激雖能促進IL-2激活的殺傷細胞的增殖，但對殺傷活性并無明顯改善，而培養(yǎng)15天以上，經(jīng)PHA預刺激的P-LAK和P-CD3AK細胞殺傷活性顯著提高，且PHA與抗CD3單抗有協(xié)同效應(yīng)。,3)TIL細胞（腫瘤浸潤的淋巴細胞）,腫瘤浸潤的淋巴細胞，是從新鮮的腫瘤組織中分離出來，體外經(jīng)IL-2

36、，抗CD3單抗，TNF等刺激，經(jīng)20-45天培養(yǎng)，獲得的具有一定特異性的抗腫瘤細胞。其局限在于分離困難，體外培養(yǎng)時間過長。,,我們于1997-1998年選擇21例癌性胸腹水患者，其中肺癌4例，乳腺癌5例，腸癌4例，骨癌7例，胰腺癌1例。所有病例均經(jīng)病理學和細胞學診斷。共抽取33次胸腹水做TIL細胞培養(yǎng)，抽取胸水250—2200ml，腹水量1200—4400ml。21例患者中14例經(jīng)1—6次的TIL胸腹腔回輸治療?；剌斊陂g隔天皮下注射IL

37、-2 50萬單位。14例患者回輸治療結(jié)果顯示總有效率為78.57%，其中3例胸腹水消失，并觀察1個月無復發(fā)，1個月后檢查胸腹水無瘤細胞；8例胸腹水有明顯減少，并控制1個月以上；3例僅控制1—2周。,4)TAK細胞,TAK是由可溶性腫瘤抗原，抗CD3單抗和IL-2共同誘導的殺瘤細胞。用可溶性腫瘤抗原誘導細胞識別腫瘤，以提高殺瘤親和性；用抗CD3單抗誘導所有T細胞活化，培養(yǎng)出以CD8+T細胞為主的殺瘤細胞。TAK細胞不僅增加了殺瘤的特異性

38、，且體外增殖快，IL-2用量低。 用胃癌可溶性抗原（TSA），聯(lián)合抗CD3單抗和IL-2共同刺激正常人的外周血單核細胞，培養(yǎng)10天后，經(jīng)流式細胞儀表型分析，表明其免疫效應(yīng)細胞以CD8+T細胞為主，其細胞增殖速度，增殖水平與CD3AK和LAK相比明顯升高，且對抗原來源的胃癌細胞具有極強的殺傷活性（98.5%），高于CD3AK（82.1%）和LAK（62.05%）。,,我們于1996-1998年，采用靜脈或口服化療和免疫效應(yīng)細胞輸注

39、為主體的化學免疫療法，治療晚期原發(fā)性肝癌18例。 收治的38例晚期原發(fā)性肝癌病人中，18例采用化學免疫療法（甲組），同期收治的晚期肝癌患者，除對癥處理外，單用靜脈化療或肝動脈插管化療20例，列為對照組（乙組）。 總緩解率（CR+PR）： 甲組22.22%（4/18） 乙組0% 無1例緩解,5)CIK細胞,是將人外周血單個核細胞經(jīng)體外用各種細胞因子共同刺激培養(yǎng)所獲得的免疫細胞。由于同時表達C

40、D3和CD56分子，故又稱為NK樣T細胞，CIK細胞兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點，其抗腫瘤活性遠大于LAK和TIL。因此被認為是新一代腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。 刺激因子除了抗CD3單抗、IL-2外，還需用IFN-γ和IL-1α等細胞因子。,CIK細胞殺傷機制,①、識別 由于CIK的細胞殺傷作用是非MHC限制性的，故CD4、CD8在其識別腫瘤細胞或病毒感染的細胞過程中并非

41、必不可少。細胞表面粘附分子LFA-1 ICAM-1在CIK細胞識別過程中起關(guān)鍵作用。對正常細胞無毒性作用。,,②、殺傷 細胞對腫瘤細胞或感染細胞的直接殺傷： CIK細胞在受到外源性抗原或敏感靶細胞刺激時會釋放具有細胞毒性的胞漿顆粒物到膜外空間，其中細胞可產(chǎn)生最大的顆粒釋放量。這些胞漿顆粒物對靶細胞具有直接殺傷作用。 炎性細胞因子的殺傷活性：培養(yǎng)的細胞可以分泌多種細胞因子，如γ、α（腫瘤壞死因子α）、等，不僅對靶細胞有直接抑

42、制作用，還可通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性間接殺傷靶細胞。 誘導腫瘤細胞凋亡：細胞在培養(yǎng)過程中表達（Ⅱ型跨膜糖蛋白），一方面增強了其對腫瘤細胞引發(fā)的凋亡的抵抗性，還可通過對（Ⅰ型跨膜糖蛋白）腫瘤細胞誘導凋亡行使其對腫瘤細胞的慢性殺傷作用，保證抗瘤活性的長期持久。,CIK細胞的殺瘤特點,1、增殖速度快 CIK細胞中的效應(yīng)細胞CD3+CD56+細胞在正常人外周血中極其罕見，僅1%～5%，在體外經(jīng)多因子培養(yǎng)28～30天，CD3+CD56+細胞

43、迅速增多，較培養(yǎng)前升幅可達1000倍以上。且所占百分比也大幅上升，細胞毒活性亦達峰值。 2、殺傷活性高、殺瘤譜廣 CIK細胞的總殺傷單位（TLU）為LAK 細胞的73倍甚至更高，CIK細胞的瘤細胞抑制Log指數(shù)為2.5～3.5，較LAK細胞的瘤細胞抑制指數(shù)高2 個Log。其抗病毒活性大大增強。 因沒有T 淋巴細胞殺傷時的MHC 限制性，故對于多種腫瘤細胞系和新鮮腫瘤組織均表現(xiàn)出強大的殺傷活性。 3、對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感 C

44、IK細胞對化療藥物敏感的親本細胞和不敏感的轉(zhuǎn)化細胞均具有強大的殺傷活性，兩者比較無差別。 4、殺瘤活性不受CsA、FK506等免疫抑制劑的影響 免疫抑制劑CsA（環(huán)孢霉素A）和FK506（普樂可復）不影響靶細胞誘導的CIK細胞脫顆粒，并且CIK細胞對靶細胞的殺傷活性不會因此降低。 5、對正常骨髓造血前體細胞毒性很小 CIK細胞對正常髓系克隆生成幾乎沒有影響，對GM-CFU（粒細胞巨噬細胞集落形成單位）僅有不足1級的抑制。 6、

45、能抵抗腫瘤細胞引發(fā)的效應(yīng)細胞Fas-FasL凋亡 CIK細胞內(nèi)有抗凋亡基因表達，并檢出多種保護基因，如Bcl-2等和survivin的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。CIK細胞具備合成FasL的能力， CIK細胞可以對抗體內(nèi)FasL陽性腫瘤所引發(fā)的效應(yīng)細胞活性下降。,CIK制備,采集：外周血單個核細胞。分離：PBMNC經(jīng)淋巴細胞分離液分離、洗滌后懸浮于含10%AB血清的RPMI 1640中。培養(yǎng)：第一天培養(yǎng)加入γ-IFN 1000U/ml，24小時

46、后加入IL-2 1000U/ml，在37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。以后每3天更換培養(yǎng)液補加IL-2 1000U/ml；培養(yǎng)7～10天。無菌檢測：細菌霉菌培養(yǎng)陰性；熱源檢測陰性。收獲：收集細胞，加入含1%白蛋白的生理鹽水洗滌。回輸：洗滌后的細胞懸浮于1%白蛋白生理鹽水中，將CIK細胞通過輸血器經(jīng)靜脈輸給患者。療程：培養(yǎng)的第8-10天開始，分八袋回輸，每次間隔1-2天。自回輸CIK細胞前一天起, 可每日靜脈輸注IL-2，每日劑量為

47、100萬單位直到回輸結(jié)束。,臨床應(yīng)用,體內(nèi)回輸CIK細胞, 可以在沒有損傷機體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下,直接殺傷腫瘤細胞, 并可調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能。 特別適應(yīng)于那些對手術(shù)、放療、化療已無適應(yīng)證的晚期腫瘤患者,因而成為治療腫瘤的重要輔助治療方法,為預防腫瘤復發(fā)、改善生存質(zhì)量提供了新途徑。 一般在放療、化療后間隔2～4周,機體免疫力有所恢復時,輸入CIK細胞,可提高腫瘤患者的緩解率并在清除微小殘留病灶方面發(fā)揮重要作用

48、。,6)DC-CIK,將外周血來源的CIK 細胞和同源DC 細胞共培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn),DC 和CIK 細胞的增殖能力明顯增強,共培養(yǎng)14 d 后CIK細胞的增殖倍數(shù)比共培養(yǎng)7d 時高出2 倍左右。共培養(yǎng)24 h 后,DC 細胞白細胞介素－12 的分泌量為單獨培養(yǎng)時的6.93 倍,與DC 細胞共培養(yǎng)的CIK 細胞對腫瘤細胞的殺傷活性顯著提高。,DC-CIK制備流程,7) NK細胞,自然殺傷細胞(natural killer ce

49、ll,NK )細胞不經(jīng)致敏可直接殺傷敏感的腫瘤細胞,是宿主抗腫瘤的第一道防線。,自然殺傷細胞(黃色)在它們嚴重破壞機體之前識別并殺死癌細胞(粉紅色)或病毒感染的細胞,NK細胞受體和配體,,,,,,中國腫瘤臨床 2013,40卷,90例食管癌中晚期患者（TNM III-IV期）接受枯息性手術(shù)后，分為單純化療組40例、化療聯(lián)合NK細胞治療MCIA陰性組（簡稱聯(lián)合MICA-組）25例及化療聯(lián)合NK細胞治療MCIA陽性組（簡稱聯(lián)合MI

50、CA+組）25例。,中國腫瘤生物治療雜志 2013,20卷,,,體細胞免疫治療聯(lián)合腫瘤常規(guī)治療的基本方案,惡性腫瘤,,手術(shù)治療,可手術(shù),,,★放化療敏感（常規(guī)放化療）放化療間隙聯(lián)合細胞免疫治療（卵巢癌、乳腺癌、小細胞肺癌和鼻咽癌等）,★ 放化療不敏感（腎癌、前列腺癌、黑色素瘤和肝癌等）,★放化療敏感（常規(guī)放化療）放化療間隙聯(lián)合細胞免疫治療（卵巢癌、乳腺癌、小細胞肺癌和鼻咽癌等）,,細胞免疫治療,疾病穩(wěn)定期,,細胞免疫

51、治療聯(lián)合內(nèi)分泌或靶向治療，細胞因子治療,,?？浦委煟ㄎ?chuàng)介入）,,,不能手術(shù)（Ⅲ期，Ⅳ期）復發(fā)者,,細胞免疫治療,疾病穩(wěn)定期,★ 化療不敏感（原發(fā)性肝癌、腎癌、前列腺癌和黑色素瘤等）,,細胞免疫治療聯(lián)合?？浦委?CIK輸注不良反應(yīng),免疫活性細胞回輸后患者可出現(xiàn)一過性類流感樣癥狀，如發(fā)熱（體溫37.5～39.5℃），輕度頭痛、乏力、關(guān)節(jié)酸痛，持續(xù)時間均不超過12 h， 可自行緩解，所有患者均能很好耐受治療。,,3、過繼性免

52、疫效應(yīng)細胞治療的優(yōu)點 (1)免疫細胞在體外處理，可繞過體內(nèi)腫瘤免疫障礙的種種機制，從而選擇性地操作抗腫瘤免疫反應(yīng): 如新鮮分離的腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）往往缺乏抗腫瘤效應(yīng)，而在體外一定條件下培養(yǎng)一段時間后可恢復特異性抗腫瘤作用；在體外培養(yǎng)條件下，腫瘤抗原特異性耐受的免疫細胞可被逆轉(zhuǎn)。,,(2)免疫細胞的活化及效應(yīng)過程往往由一些細胞因子介導，而目前基因工程可大量克隆不

53、同的細胞因子，也可大量克隆腫瘤抗原或多肽，這使體外活化擴增大量的抗腫瘤免疫細胞更為可行方便。,,(3)免疫細胞的體外活化擴增可避免一些制劑 體內(nèi)大量應(yīng)用帶來的嚴重毒副作 用，如: IL－2、TNF－α、IL－4、IL－7、IL－12等具有抗腫瘤作用，抗CD3單克隆抗體(MabCD3)的體內(nèi)應(yīng)用可激活T淋巴細胞，但這些制劑由于其復雜的多種作用，在體內(nèi)大量應(yīng)用可導致嚴重的甚至致死性副作用，這也是這些因子難以被批準臨床使用的重要原因，

54、而在體外操作可避免這些副作用。,,(4)目前已能在體外大量擴增自體或異基因的抗腫 瘤免疫細胞，其數(shù)量大于腫瘤疫苗在體內(nèi)激活的效 應(yīng)細胞數(shù)，一些體外培養(yǎng)的免疫細胞已進入臨床治 療試驗。 實驗顯示腫瘤疫苗在體內(nèi)應(yīng)用可增加體內(nèi)的腫瘤特異性CTL數(shù)量，但到一定時候，體內(nèi)的CTL到達平臺期而不再增加，這主要由體內(nèi)存在的特異性及非特異性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)限制了CTL克隆的擴增。而在體外培養(yǎng)可突破此調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，大量擴

55、增免疫效應(yīng)細胞。,,理想的過繼性免疫細胞治療應(yīng)具有以下特點: (1)可大量獲得，實驗室研究及臨床實踐顯示，臨床治療量的免疫細胞應(yīng)在1×1010以上 (2)為腫瘤特異性 (3)抗腫瘤活性強 (4)體內(nèi)應(yīng)用可耐受 (5)可聚集在腫瘤灶 (6)可在體內(nèi)存活 、增殖,二、免疫治療的作用,腫瘤免疫治療即能夠直接清除體內(nèi)的殘存腫瘤細胞，又能夠提高機體的整體免疫功能，還具有將患者個體化的腫瘤

56、抗原信息遞呈給體內(nèi)腫瘤免疫殺傷細胞的獨特作用。 腫瘤免疫治療已成為臨床上繼手術(shù)、化療、放療之后的第四種最有效的腫瘤治療方法。在腫瘤綜合治療方案中，免疫治療成為提高腫瘤治愈率和有效率的一個關(guān)鍵措施。,三、免疫治療的臨床地位,免疫治療是最有前途的抗腫瘤手段之一目前尚未起主導作用定位于手術(shù)、放化療后清除殘留病灶目標是預防復發(fā)關(guān)鍵是抗原在體內(nèi)有效地被遞呈并激 活T淋巴細胞,四、免疫治療的原則,雖然目前免疫治療的方法還

57、不是很有效的，只能配合其他療法作為一種 輔助手段。但從腫瘤免疫的理論看，它涉及的是腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)部因素和內(nèi)部矛盾性。隨著它的迅速發(fā)展，為腫瘤的免疫治療提出了廣泛的可能。 從宿主與腫瘤相互斗爭這一矛盾出發(fā)，從增強宿主對腫瘤的免疫能力，以及消除腫瘤對免疫功能的抑制兩個方面入手，并繼續(xù)在增強機體非特異性免疫能力方面進行研究，腫瘤的免疫治療是大有希望的。,,1、增強宿主對腫瘤的免疫能力：1）提純改造抗原，提高抗原的免疫作用2）發(fā)

58、揮細胞免疫的作用進行過繼免疫治療3）利用細胞因子激活抗腫瘤免疫4）抗體導向治療2、消除腫瘤對免疫的對抗 如何清除免疫抑制因子的作用，是腫瘤免疫治療很有希望的一個方面。,五、免疫治療的評價,1、臨床評價： 病灶變化---臨床查體和影像學檢查（CT、 MRI、B超、等） 內(nèi)鏡檢查 腫瘤標志物 肝功、腎功、血象等的改善 其他,,腫瘤標志物（tumor markers,T

59、M),1978年NCI提出1979年確認并開始使用TM是表示腫瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物質(zhì)TM主要是指那些在血液、體液及組織中可檢測到的與腫瘤相關(guān)的物質(zhì)，這些物質(zhì)達到一定的水平時能揭示某些腫瘤的存在。TM的臨床意義： （1）診斷 （2）復發(fā)（3）判斷療效（4）預后,常用腫瘤標志物,甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）糖類抗原（CA50、CA125、CA15-3、CA199、CA242、CA72-4）

60、3;2-微球蛋白（ ß2-MG）鐵蛋白（Ft）細胞角質(zhì)素片段抗原21-1（CYFRA21-1）神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）鱗狀上皮癌相關(guān)抗原（SCC-Ag）前列腺特異抗原（PSA）前列腺酸性磷酸酶（PAP）核基質(zhì),,2、免疫監(jiān)測 ----觀察CTL的反應(yīng)、認定CTL反應(yīng)的細胞類型、等，從而評價機體對免疫治療的反應(yīng)1）遲發(fā)超敏試驗（DTH） ---體內(nèi)抗原特異性免疫監(jiān)測技術(shù)2）機體

61、免疫功能檢測 體液免疫指標：定量分析抗原特異性抗體的數(shù)量和功能－－檢驗科 細胞免疫功能：FCM技術(shù)檢測淋巴細胞表面標志 CD3、CD4、CD8、CD19、CD28、CD16/CD56、CD25、HLA-DR、等等。－－實驗室 Th1、Th2類因子檢測：應(yīng)用FCM-CBA技術(shù)，采用磁珠微陣列技術(shù)，同時測定血清中4－6種免疫相關(guān)因子的水平－－實驗室,,3）T細胞增殖反應(yīng) ---3H測定法

62、4）T細胞毒性檢測： 51Cr釋放試驗 LDH MTT （WST-1）5）T細胞限制性稀釋分析法（LDA） ---分析未知頻率的淋巴細胞克隆、定量檢測外周血中最初抗原T特異性淋巴細胞的數(shù)目或頻率。 操作復雜，被ELISPOT等新技術(shù)所取代,,6）細胞因子檢測 ---測定T淋巴細胞分泌的因子ELISA（酶聯(lián)免疫技術(shù)）---檢測T淋巴細胞分泌于細胞外的因

63、子ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)）---檢測T淋巴細胞分泌于細胞外的因子FCM（流式細胞術(shù)）---檢測T淋巴細胞胞內(nèi)細胞因子,,7）其他P-MHC tetramer技術(shù)---檢測細胞表面受體（TCR）與MHC分子遞呈的多肽的相互作用定量PCR技術(shù)---檢測細胞因子基因、T細胞受體復合物基因等表達水平，反應(yīng)T淋巴細胞功能狀態(tài) ……,六、腫瘤免疫治療的新進展,1、免疫卡控點抑制劑 Checkpoimt inhibi

64、tor CTLA4、 PD-1、 PD-L1 2、TCR-T和CAR-T,,,T,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,B7,CD28,MHC-I,Ag,TCR,TCR,Ag,MHC-I,,,,,,,,,,,,IL-2,,APC,Tumor,T,T,T,T,T,耐受,激活,,,CD28,協(xié)同刺激分子作用示意圖,T,1、T細胞免疫卡控點治療,有兩種受體存在于T細胞表面B7 CD28 低親和力受體

65、 CTLA-4 高親和力受體B7 傳遞陽性或陰性信號決定于T細胞上的配基 B7-CD28結(jié)合:產(chǎn)生陽性信號，增強免疫反應(yīng)。封閉 CD28依賴的T細胞激活，下調(diào)免疫反應(yīng)。 B7-CTLA-4結(jié)合:產(chǎn)生陰性信號，下調(diào)免疫反應(yīng)。封閉 CTLA-4促進抗腫瘤反應(yīng)。,,The Biology of Cancer,抗CTLA-4抗體治療黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移患者,,Ipilimumab治療復治轉(zhuǎn)移性黑色素瘤(fully

66、 human, IgG1 monoclonal antibody, anti-CTLA-4),,結(jié)果提示：Ipilimumab能夠延長轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的總生存，故2011年通過FDA批準用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。,入組標準：二線治療（化療或細胞因子治療失敗）；HLA-A* 0201排除標準：既往CTLA-4抗體或疫苗治療；免疫抑制劑或自身免疫疾??；腦轉(zhuǎn)移、脈絡(luò)膜黑色素瘤,Early Response to Therapy,

67、Cancer Investigation, 30:712–720, 2012,Gradual/Delayed Response,Cancer Investigation, 30:712–720, 2012,2011年，《Nature》雜志指出：“腫瘤免疫治療的時代已經(jīng)來臨”。,抗PD-1抗體治療黑色素瘤肺、肝轉(zhuǎn)移患者,T h e new engl and journa l o f medicine,CD8+,RECIST，為38

68、%（44 / 117例）,,Checkpoint Inhibitor: Nivolumab (BMS-936558)(fully human, IgG4 monoclonal antibody, anti-PD-1),Durable OR was observed in patients with melanoma, NSCLC and RCC.,該研究中NSCLC患者的給藥濃度分別為1mg / kg、3mg / kg 和10mg /

69、 kg ；76例可評價療效NSCLC患者的ORR達18%；鱗癌與非鱗癌患者的ORR分別為33 % (6/18 ) 和12 %(7/58)。,,2、TCR-T和CAR-T,基本概念,1、T細胞（抗原）受體（T cell receptor ,TCR） TCR為所有T細胞表面的特征性標志，以非共價鍵與CD3結(jié)合，形成TCR—CD3復合物。TCR的作用是識別抗原。 2、TCR-T TCR基因轉(zhuǎn)染的T細胞免疫治

70、療 3、嵌合抗原受體(CAR) 是通過基因改造的T細胞抗原受體，賦予T細胞HLA非依賴的方式識別腫瘤抗原的能力，CAR的基礎(chǔ)設(shè)計中包括一個腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen， TAA）結(jié)合區(qū)（通常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scFV段），一個胞外鉸鏈區(qū)，一個跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)信號區(qū)。目標抗原的選擇對于CAR的特異性、有效性以及基因改造T細胞自身的安全性來講都是關(guān)鍵的決定因素。