血片制作染色和血檢質(zhì)量控制

1、1,一、血片制作,血膜的制作用于檢查瘧原蟲的血涂片有兩種：一種是將血液涂呈薄膜狀，稱薄血膜；一種是血液涂成圓盤，稱厚血膜。薄血膜上的血細(xì)胞要求平輔在玻片上面。,發(fā)熱病人血片,標(biāo)本片,2,血膜的制作（取血時間）,取血時機 現(xiàn)癥病人一般可隨時取血，瘧疾普查時可不考慮取血時機。但在診斷或需要某期瘧原蟲作標(biāo)本時，則應(yīng)掌握適宜的取血時機。 間日瘧在寒熱發(fā)作時，外周血液中主要可見環(huán)狀體期；發(fā)作后數(shù)小時，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形

2、態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷的有利時機；36~48小時，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現(xiàn)較多。惡性瘧較理想的取血時間是在發(fā)作后至20小時內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲。,3,血膜的制作（取血操作）,取血方法 采血部位一般人為耳垂，指頭，通常在耳垂取血（現(xiàn)場取血用采血針采血，一人一針，避免血傳疾病）先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻動耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方，右手持消毒針迅速刺入耳

3、垂下端1~2毫米，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕向上擠壓出血。,4,取血量及涂片法（涂片操作）,薄血膜 取潔凈的載玻片2張，1張平置在桌上，以左手拇指，食指夾持載玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點從取血部分取約1微升的血量（相當(dāng)于1/4火柴頭大?。寡闻c平置的載玻片接觸，并形成25~30度夾角，待血液向兩側(cè)擴展約2厘米長度時，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.

4、5厘米長）。,5,（涂片操作）,厚血膜 用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。寡闻c平置的載玻片接觸，再由里向外或由外向里一個方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。,6,血膜的制作（涂片操作）,涂制厚、薄血膜的位置 通常是將厚、薄血膜涂在一張載片上。方法是將載片分為6等分，第1、2格備貼標(biāo)簽及編號用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第

5、4格前緣至第6格中部。作為標(biāo)本的血片每張玻片涂厚、薄血膜各1個；門診和發(fā)熱病人血片 涂2個厚血膜1個薄血膜，以 防血膜脫落而影響檢查； 瘧疾調(diào)查時，每張玻片 可涂制2~3人血膜。,7,血膜的制作,血膜編號 血膜制成后，立即用特種蠟筆或水筆于玻片面上寫上受檢者的號碼，以防差錯，待薄血膜干后再用鉛筆于薄血膜中寫上血片種類的代號和受檢者的個人編號，依次順序插入標(biāo)本盒內(nèi)。,8,制作血膜的注意事項,1. 玻片清洗時，避

6、免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無油漬或污垢。制片時，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。,9,制作血膜的注意事項,2. 剛涂制的血膜要平放在標(biāo)本盒內(nèi)，厚血膜未干前勿使標(biāo)本盒傾斜，以免血膜傾向一側(cè)，造成血膜厚薄不均，厚處不一溶血和著色而影響檢查結(jié)果；晾干血膜時應(yīng)注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲吮吸血膜，干后應(yīng)及時裝入標(biāo)本

7、盒并蓋嚴(yán)，新的木制標(biāo)本盒需敞開放置一段時間，讓木醇揮發(fā)后才能使用，以免厚血膜紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。,10,制作血膜的注意事項,3. 血膜讓其自然干燥，切忌用太陽曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天標(biāo)本盡可能24~48小時內(nèi)固定染色；冬天也不能超過72小時。放置時間越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及時染色，膜血膜宜先用甲醇固定（1~3分鐘）然后用過濾清水對厚血膜溶血，晾干固定后裝入盒內(nèi)蓋嚴(yán)，待以后染色。

8、,11,二、血片的染色（一）染液的種類及染色原理,染液種類：目前所用的血片染色液，雖然名稱很多，但都是從羅門諾夫斯基氏創(chuàng)造的染液變化過來的。總的可分為水溶液和酒精溶液兩大類，前者包括羅氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液等。這些染液中的主要染劑都包含美蘭、伊紅和由美蘭氧化所成的天青，所以稱多色性染劑。,12,血片的染色（一）染液的種類及染色原理,染色原理：伊紅是酸性水溶性鈉鹽，

9、美蘭是堿性水溶性鹽酸鹽，當(dāng)它們各自溶化水中時，就離解為帶陽電和陰電的離子。伊紅主要離解為酸性的陽離子，在遇到堿性的蛋白質(zhì)如血紅蛋白、嗜伊紅白血球顆粒等即可結(jié)合成不易溶于水的沈淀物染成紅色。美蘭主要離解為堿性的美蘭離子，美蘭就與瘧原蟲、淋巴和大單核細(xì)胞的胞漿、嗜堿性白細(xì)胞的顆粒等酸性蛋白質(zhì)結(jié)合染成蘭色。#,13,血片的染色（一）染液的種類及染色原理,染色原理：美蘭與伊紅都不能使原蟲和白細(xì)胞的核著色，必須由天青作為媒介（染媒）才能使其著色

10、。天青雖然也是堿性染劑，但又具有染媒作用，使原蟲核和白細(xì)胞核等原來只能染上極淡蘭色的結(jié)構(gòu)染上顯著的酸性染劑伊紅，這樣，就使白細(xì)胞粗大的核染成顯著的既蘭又紅的紫蘭色，而較小或菲薄的原蟲核和淋巴細(xì)胞原漿中的顆粒染成紫紅色。,14,血片的染色（一）染液的種類及染色原理,注意：蛋白質(zhì)是二性電解質(zhì)，當(dāng)其處于較等電點為酸的溶液中時，便呈鹼的作用，即與酸結(jié)合* ，這就說明為何在染液偏酸時，伊紅的著色力強，使紅細(xì)胞著色鮮艷而淋巴細(xì)胞和原蟲的胞漿著色不

11、著；反之，蛋白質(zhì)在偏鹼的溶液中呈酸的作用而中和鹼基，也就說明為何染液偏鹼時，紅細(xì)胞和嗜伊紅白細(xì)胞的顆粒等被染成紫蘭色。 伊紅在水溶液內(nèi)遇到美蘭或天青，時間一長即可互相化合而產(chǎn)生沈淀從而失去染色力，因此，吉氏母液絕對不能進水。,15,血片的染色（二）吉氏染液母液配置方法,取吉氏粉0.5克置于研缽中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完為止，倒入60或100毫升帶有玻塞的有色玻瓶中。在研

12、缽中加少量甲醇，洗去甘油濃液混入瓶內(nèi)，至25毫升甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于55~60℃水浴中或溫箱內(nèi)24小時或室溫內(nèi)3~5天，多加搖動，即成原液。吉氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經(jīng)久不變。,材料： 1、吉氏粉0.5克 2、甘油25毫升 3、甲醇25毫升,16,血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法,先用甲醇或無水酒精固定薄血膜，待干后進行染色。亦可在固定薄血膜后

13、用清水對厚血膜溶脫血紅蛋白，然后才進行染色。 成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀釋液（2毫升原液加中性蒸餾水98毫升稀釋均勻即成），同時對厚薄血膜染色30分鐘（如染液不合標(biāo)準(zhǔn)時，得酌情增減染色時間），然后用清水輕輕將染液沖去，再用清水輕輕沖洗一次，干凈后將血片標(biāo)本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干鏡檢。,17,血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法,先用甲醇或無水酒精固定薄血膜，待干后進行

14、染色。亦可在固定薄血膜后用清水對厚血膜溶脫血紅蛋白，然后才進行染色。 單張血片染色：薄血膜經(jīng)固定干燥后，用2%吉氏染液稀釋液1~2毫升，滴入血片標(biāo)本上染色30分鐘左右，或用中性蒸餾水1毫升，加吉氏母液1~2滴，混合均勻后滴入血片標(biāo)本上，染色10~20分鐘，然后用清水輕輕將片上的染液沖洗干凈，晾干鏡檢。,18,影響染色效果的因素,血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質(zhì)量好壞等有關(guān)外，還受到以下幾個因素的影響：（1

15、）染料溶劑的質(zhì)量 染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時所用的器具必須干凈而無水份。,19,影響染色效果的因素,（2）染液的新舊 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常呈現(xiàn)偏堿性。染液存放時間越久，染色力越強。通常在染液配制1~2周后才使用，盛裝染液的瓶子應(yīng)加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質(zhì)量。,20,影響染色效果的因素,（3）染液稀釋后使用時間 吉氏和

16、瑞氏染液的主要成份是美藍(lán)、伊紅和由美藍(lán)氧化產(chǎn)生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍(lán)和天青即產(chǎn)生沉淀。因此，必須在稀釋染液當(dāng)時使用，一般在半小時內(nèi)染色力最強。,21,影響染色效果的因素,（4）染液的稀釋濃度 染液的濃度高其著色就快而深，從而瘧原蟲寄生紅細(xì)胞的薛氏點粗大顯著，但顏色常偏堿；染液濃度過低則染色時間久，顏色偏酸，薛氏點不明顯或消失。,22,影響染色效果的因素,（5）染色時間 染色時間長染色效果好，反之較差

17、。室溫高則著色快，染色時間可略縮短，氣溫低可適當(dāng)延長。因此染色時間應(yīng)根據(jù)染液的質(zhì)量、新舊、稀釋濃度和氣溫而適當(dāng)增減。,23,影響染色效果的因素,（6）染色用水 染液的稀釋用水和染色后沖洗用水應(yīng)選擇Ph7.0~7.2清潔水，通常使用的新鮮的蒸餾水或過濾的冷開水，以及自來水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏堿，可用緩沖蒸餾水調(diào)整。染色后發(fā)現(xiàn)血膜顏色偏藍(lán)（偏堿）或偏紅（偏酸）時，可用與之相反的酸、堿度水沖洗血片予以糾正。,24,影響染

18、色效果的因素,（7）染色后不要直接將染液倒掉，應(yīng)沿玻片或染色缸邊緣加水使染液表面一層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污血膜。,25,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,19世紀(jì)后期，顯微鏡的出現(xiàn)使人們不斷發(fā)現(xiàn)了傳染病的病因，1880年法國軍醫(yī)拉韋朗（Laveran）第一次見到并描述了人紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲，至此才解開了困擾人們數(shù)千年的瘧疾的病因之謎。,26,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,此后，隨著顯微鏡的不斷改進和血膜上瘧原蟲染色方法的出現(xiàn)，使顯

19、微鏡檢查瘧原蟲的方法成為瘧疾病原學(xué)診斷的重要手段。盡管這種方法存在著操作復(fù)雜、技術(shù)難于掌握等缺點，但以其高特異性一直被作為確診病例主要依據(jù)。時止今日，由于技術(shù)的、經(jīng)濟的等原因，鏡檢瘧原蟲仍是我國瘧疾病例確診的金標(biāo)。,27,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,在瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)中把瘧疾病例分為疑似病例、臨床病例、確診病例和帶蟲者，前兩者依據(jù)流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)即可做出診斷，而后兩者需通過發(fā)現(xiàn)病原方能做出診斷。另外，除帶蟲者外，病例的最基本臨床表現(xiàn)為發(fā)

20、熱。,1 、目的與意義,28,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,因此血檢的目的在于通過對發(fā)熱病人血檢達(dá)到確診瘧疾病例。它的意義在于及時發(fā)現(xiàn)傳染源和明確感染的瘧原蟲種類，以能針對蟲種選擇正確的治療方案。,1 、目的與意義,29,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,在瘧疾嚴(yán)重流行時期，衛(wèi)生部有關(guān)文件中提出，瘧區(qū)的各級醫(yī)療衛(wèi)生單位，都要把發(fā)熱病人血檢瘧原蟲列為常規(guī)。,2 、血檢對象,30,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,2 、血檢對象,但根據(jù)20世紀(jì)80年代各

21、地的觀察結(jié)果表表明，全部血檢陽性的病例中，有47.8%（江蘇）、73.5%（山東）、77.7%（南方7省）、84.1%（河南）是在臨床初診為瘧疾、疑似瘧疾的發(fā)熱病中查出的，而其它15%~42%的病例，是在臨床初診為發(fā)熱原因不明和感冒及其它發(fā)熱病人中查出的。,31,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,2 、血檢對象,因此，為盡可能多地發(fā)現(xiàn)病人，各地把臨床初診為瘧疾、疑似瘧疾、發(fā)熱原因不明和感冒及其它發(fā)熱的“四熱”病人列為血檢對象。,32,三、發(fā)熱

22、病人血檢的質(zhì)量控制,2 、血檢對象,但是，隨著瘧疾流行程度的降低，“四熱”病人中查出的瘧疾病例所占的比例也發(fā)生了變化。上世紀(jì)90年代初，在全國10 省、區(qū)發(fā)病率穩(wěn)定在1/萬以下地區(qū)開展研究，發(fā)現(xiàn) 92.33 %的病例發(fā)生在臨床診斷為瘧疾、疑似瘧疾（包括來自高瘧區(qū)流動人口）中（見表）。,33,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,2 、血檢對象,表 各類發(fā)熱病人血檢原蟲陽性率,34,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,2 、血檢對象,表中顯示，在診斷為發(fā)

23、熱原因不明的病人中，原蟲陽性率僅為0.02%，也就是說檢出1例病人要鏡檢5000張以上血片；而在“其它”發(fā)熱病人中檢查2.4萬病人方檢出1例病人。,35,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,2 、血檢對象,因此提出發(fā)病率在1/萬地區(qū)，由于92%以上的病例在診斷為瘧疾、疑似瘧疾（包括來自高瘧區(qū)流動人口）“二熱”病人中發(fā)現(xiàn)，因此以“二熱”病人為血檢對象即可。至于在發(fā)熱原因不明中查出的7%病例，可在其出現(xiàn)疑似瘧疾的癥狀時再做血檢，這就極大的減少了工作

24、量。,36,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,2 、血檢對象,提供以上資料，僅供在確定血象時參考，各地可根據(jù)當(dāng)?shù)氐寞懠擦餍谐潭?、血檢的具體目的來確定血檢對象。,37,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,3 、血檢率,發(fā)熱病人血檢率是指血檢的人數(shù)占血檢范圍人口的比率。血檢率的高低應(yīng)以瘧疾的流行程度來定。20世紀(jì)50年代WHO提出，在實施抗瘧計劃的攻擊期，年血檢率在10%以上。我國基本消滅瘧疾標(biāo)準(zhǔn)中提出年血檢率5%以上。,38,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制

25、,3 、血檢率,在目前，年檢率應(yīng)多高？各地應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)丿懠驳牧餍兴?，在以臨床初診為瘧疾和疑似瘧疾為重點的基礎(chǔ)上，來確定血檢對象。,39,三、發(fā)熱病人血檢的質(zhì)量控制,3 、血檢率,根據(jù)上世紀(jì)90年代初，在全國10 省、區(qū)發(fā)病率穩(wěn)定在1/萬以下地區(qū)研究結(jié)果，如果以“二熱”病人為血檢對象，年血檢率在0.36%即可，這樣可發(fā)現(xiàn)92%的病人；如果要發(fā)現(xiàn)99%的病人，血檢對象就應(yīng)是臨床初診為瘧疾、疑似瘧疾和發(fā)熱原因不明的“三熱”病人，年血檢率要達(dá)到