實驗四 血涂片的制備與染色

1、實驗四血涂片的制備與染色【目的】掌握血涂片的制備和染色方法（preparationstainingofthinbloodfilms）。【原理】將一小滴血液均勻涂在玻片上，呈單層緊密分布，制成薄血片。用含天青B和伊紅的Romannowsky類染料進行染色。細胞中的堿性物質(zhì)如RBC中的血紅蛋白及嗜酸性粒細胞胞質(zhì)中的嗜酸性顆粒等與酸性染料伊紅結(jié)合染成紅色；細胞中的酸性物質(zhì)如淋巴細胞胞質(zhì)及嗜堿性粒細胞質(zhì)中的嗜堿性顆粒等與堿性染料亞甲藍結(jié)合染成藍

2、色；中性粒細胞的中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結(jié)合，染成淡紫紅色?！酒鞑摹?載玻片使用前，必須仔細清洗，并用乙醇或軟布清潔。2推片選擇邊緣光滑的載玻片，在兩角分別作斜線標記，然后用玻璃切割刀裁去兩角，制成約15mm寬度的推片。3吸耳球。4顯微鏡。5酒精燈或Bunsen燈。6采血針。7注射器和針頭?！驹噭?瑞氏（Wright）染液（1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、純甲醇（AR級以上)600ml、甘油15ml。將全部染料放入清潔干燥的

3、乳缽中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混勻，然后將溶解的部分倒入潔凈的棕色瓶內(nèi)，乳缽內(nèi)剩余的未溶解的染料，再加入少許甲醇細研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完為止。再加15ml甘油密閉保存。（2）Ⅱ液：磷酸鹽緩沖液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.3g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）0.2g、蒸餾水加至1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口貯存。如無緩沖

4、液可用新鮮蒸餾水代替。2吉姆薩染液包含吉姆薩染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。將吉姆薩染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器內(nèi)，每天混勻3次，連續(xù)4天，最后過濾備用。3瑞吉復(fù)合染液（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆薩染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。將瑞氏染料和吉姆薩染料置潔凈研缽中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此連續(xù)幾次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各搖3min，共5d，以后存放1周即

5、能使用。（2）Ⅱ液：即磷酸鹽緩沖液（pH6.4～6.8）。包含無水磷酸二氫鉀6.64g、無水磷酸氫二鈉2.56g，加少量蒸餾水溶解，用磷酸鹽調(diào)整pH，加水至1000ml?！緲吮尽縀DTA抗凝靜脈血或末梢血?！静僮鳌?采血（1）靜脈采血法：用EDTAK2抗凝1～2h內(nèi)的標本，使用玻棒、毛細管、注射針頭等在距載玻片一端1cm處加1滴抗凝血，直徑約4mm。（2）皮膚采血法：選擇第三、四手指，并先采紅細胞、白細胞計數(shù)，再采血1滴置潔凈玻片上用于

6、血涂片制備。高的患者應(yīng)采用小血滴、小角度、慢推；而貧血患者則應(yīng)采用大血滴、大角度、快推。涂片質(zhì)量不佳及可能原因見表11，圖113。表11涂片質(zhì)量不佳及可能原因涂片質(zhì)量不佳可能原因不規(guī)則間斷和尾部太長推片污染、推片速度不連續(xù)、載玻片太臟有空洞載玻片污染脂肪、油脂白細胞和血小板尾部分布不規(guī)則制片技術(shù)差涂片太長或太短推片角度不佳涂片沒有尾部血滴太大涂片很短血滴太小涂片沒有邊緣空隙推片太寬有細胞退變現(xiàn)象固定延遲、固定時間太短、甲醇污染血涂片厚血

7、滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快白細胞破損推片時用力過猛圖113血涂片質(zhì)量比較（A為涂片質(zhì)量好，B、C、D、E、F、G、H、I為涂片質(zhì)量差）4干燥涂片血涂片干透后方可固定染色，否則細胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色過程中容易脫落。5染色步驟（1）操作注意事項及操作不當?shù)暮蠊姳?3。表12染色操作注意事項及操作不當?shù)暮蠊僮髯⒁馐马棽僮鞑划數(shù)暮蠊尤疽簯?yīng)適量過少則易蒸發(fā)沉淀，一旦染料沉積在血涂片上，則不易沖洗，使細胞深染不易檢查。

8、沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖洗染料沉著在血涂片上沖洗時間不能過久脫色沖洗完的血涂片應(yīng)立放于支架上剩余水分浸泡脫色（2）染色時間與染液濃度、室溫及細胞多少有關(guān)。染液淡、室溫低、細胞多則染色時間要長；反之，可減少染色時間。必要時可增加染液量或延長時間。沖洗前，應(yīng)先在低倍鏡下觀察有核細胞是否染色清楚，核質(zhì)是否分明。應(yīng)該在具體實踐中摸索合適的時間，特別是在更換染液時。每批染色液和緩沖液，均需試染，以便掌握染色時間和加緩沖液的比例。6結(jié)果觀察