中藥的一般毒性作用

1、第六章 中藥的一般毒性作用,毒性作用,特殊毒性：致畸、致突變、致癌,基礎(chǔ)毒性：急性毒性、長(zhǎng)期毒性等,,均是安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分,第一節(jié) 急性毒性與急性毒性試驗(yàn),意義：毒理學(xué)研究中最基礎(chǔ)的工作了解中藥對(duì)機(jī)體產(chǎn)生急性毒性的主要依據(jù)安全性評(píng)價(jià)的第一步工作在不同的化學(xué)品的法規(guī)程序中通常是必做試驗(yàn),一、急性毒性(acute toxicity)的概念急性毒性是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次或24小時(shí)內(nèi)多次接觸某一中藥后，在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性作用及死亡

2、。“一次”：對(duì)經(jīng)口、注射途徑給藥是指瞬間給予動(dòng)物給藥，在經(jīng)呼吸道或皮膚給藥時(shí)，指一段規(guī)定時(shí)間內(nèi)使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)接觸中藥的過(guò)程?！岸啻巍保褐府?dāng)中藥毒性很低時(shí)，一次給予最大給藥容量仍不能充分了解該中藥急性毒性作用，需要24小時(shí)內(nèi)多次給藥。國(guó)內(nèi)多數(shù)規(guī)范規(guī)定24小時(shí)內(nèi)一般不超過(guò)3次。,二、急性毒性試驗(yàn)的目的1、通過(guò)測(cè)定以L(fǎng)D50為主的相關(guān)參數(shù)，評(píng)價(jià)中藥對(duì)機(jī)體急性毒性的大小，并根據(jù)LD50值進(jìn)行急性毒性分級(jí)。2、通過(guò)觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn)，毒作用

3、強(qiáng)度和死亡情況，初步評(píng)價(jià)中藥對(duì)機(jī)體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系和對(duì)人體產(chǎn)生損害的危險(xiǎn)性。3、為后續(xù)重復(fù)劑量、亞慢性和慢性毒性研究以及其它毒理試驗(yàn)提供接觸劑量設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)選擇依據(jù)。4、為毒理學(xué)機(jī)制研究研究提供初步線(xiàn)索。,三、急性毒性試驗(yàn)的主要毒性參數(shù)(一)上限參數(shù)，以死亡為終點(diǎn)：1、絕對(duì)致死劑量或濃度(LD100或LC100)2、半數(shù)致死劑量或濃度(LD50或LC50)3、最小致死劑量或濃度(MLD、LD01

4、或LC01)4、最大非致死劑量或濃度(MNLD、LD0或LC0)(二)下限參數(shù)，以非致死性急性毒作用為終點(diǎn)：1、急性毒性L(fǎng)OAEL(觀察到有害作用最低劑量)2、急性毒性NOAEL,四、急性毒性試驗(yàn)要點(diǎn)中藥種類(lèi)不同，急性毒性試驗(yàn)的程序和要求有所不同。但總體原則和要點(diǎn)相似。常用給藥途徑：經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮、注射(一)經(jīng)典的急性(致死)毒性試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和處置種類(lèi)：嚙齒類(lèi)：一般為大、小鼠，大鼠為首選

5、 非嚙齒類(lèi)：犬(Beagle犬)體重：變異不超過(guò)平均體重的20% 大鼠180~240g，小鼠18~25g， 兔2~2.5kg，犬10~15kg，豚鼠200~250g,數(shù)量及性別： 嚙齒類(lèi)：每個(gè)劑量組每種性別至少5只 非嚙齒類(lèi)：雌雄兼用，每組同一性別動(dòng)物數(shù)應(yīng)相等 雌性應(yīng)為未孕和未產(chǎn)過(guò)仔 雌雄分籠飼養(yǎng)適應(yīng)期：

6、 必須有5~7天適應(yīng)期，剔除異常動(dòng)物禁食： 經(jīng)口給藥，要求試驗(yàn)前對(duì)動(dòng)物禁食 大鼠過(guò)夜禁食，小鼠禁食4小時(shí)，大動(dòng)物在每日上午喂食前給予受試物。給藥后繼續(xù)禁食3~4小時(shí),2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量：急性毒性試驗(yàn)是否成功的基礎(chǔ)了解受試物結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下?tīng)顟B(tài)、生產(chǎn)批號(hào)、純度、雜質(zhì)與含量、溶解度、PH等根據(jù)受試物有關(guān)測(cè)試規(guī)范要求中藥成分根據(jù)與其化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似化合物毒性資料作參考以較大間隔(按幾

7、何級(jí)數(shù))給藥，找出10%~90%(或0%~100%)的致死劑量范圍在這個(gè)劑量范圍內(nèi)以合適的間距設(shè)若干劑量組，至少3組(一般5~7組)，以產(chǎn)生一系列毒效應(yīng)和死亡率不同急性毒性試驗(yàn)方法，對(duì)劑量設(shè)計(jì)和動(dòng)物數(shù)要求不同可不設(shè)陰性對(duì)照組,觀察：一般觀察14天，也可根據(jù)毒性反應(yīng)、癥狀發(fā)生的速度和恢復(fù)期長(zhǎng)短而定，有必要時(shí)可延長(zhǎng)。每天觀察至少一次，并作詳細(xì)、系統(tǒng)記錄觀察中毒體征：皮膚、被毛、眼睛和黏膜改變、呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢

8、活動(dòng)和行為方式的變化記錄發(fā)生每種體征的時(shí)間、表現(xiàn)程度、發(fā)展過(guò)程及死亡前特征和死亡時(shí)間于給藥前、給藥后每周(每天)和死亡時(shí)測(cè)定體重所有動(dòng)物均應(yīng)進(jìn)行大體尸體解剖，記錄觀察到的全部病變，包括各器官有無(wú)充血、出血、水腫或其它改變，必要時(shí)作病理組織學(xué)檢查(存活24小時(shí)以上動(dòng)物)。,LD50計(jì)算LD50是一個(gè)統(tǒng)計(jì)量，可報(bào)告其95%可信限計(jì)算方法：概率單位圖解法 Bliss法(較精確，新藥

9、指南推薦) 改良寇氏法 霍恩法(查表，精確度差),五、經(jīng)典急性致死性毒性試驗(yàn)的局限性L(fǎng)D50意義(OECD，1987)：1、標(biāo)準(zhǔn)化藥物毒性強(qiáng)度，評(píng)價(jià)藥物對(duì)機(jī)體毒性的大小，比較不同藥物毒性的大小；2、計(jì)算藥物的治療指數(shù)，藥效學(xué)劑量和毒性劑量的距離；3、為后續(xù)的重復(fù)毒理學(xué)試驗(yàn)劑量的選擇提供參考；4、通過(guò)比較不同途徑的LD50值，

10、獲得生物利用度信息；5、試驗(yàn)結(jié)果可用來(lái)推測(cè)人類(lèi)的致死劑量以及中毒后體征，為臨床毒副反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考。,局限性：1、對(duì)于上述大多數(shù)目的，LD50值不能給予有效的信息，其可用性十分有限。a、LD50值不能等同于急性毒性，死亡僅僅是評(píng)價(jià)急性毒性的許多觀察終點(diǎn)之一。b、單次大劑量中毒，動(dòng)物多死于CNS及心血管功能障礙，并不能很好顯示出各自的毒作用特征。c、由于死亡迅速，各種器質(zhì)性變化尚未發(fā)展，不能顯示靶器官的病變。d、對(duì)亞急性毒性劑

11、量的選擇，可用簡(jiǎn)單的使用很少動(dòng)物重復(fù)試驗(yàn)代替，且能提供更多有用信息。2、 LD50沒(méi)有穩(wěn)定的數(shù)值,3、由于急性毒性劑量與臨床人用劑量相差很大，不能期望用急性毒性試驗(yàn)結(jié)果來(lái)擬定人的臨床用量。4、人和動(dòng)物的敏感性相差很大。對(duì)于急救醫(yī)生和中毒控制中心，LD50試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)于醫(yī)學(xué)診斷和治療意義不大。5、消耗動(dòng)物多，受到廣泛的倫理學(xué)和科學(xué)批評(píng)。6、對(duì)于開(kāi)發(fā)新藥，沒(méi)有必要求出精確的LD50值，所要關(guān)注的是動(dòng)物出現(xiàn)毒性和劑量間的量效關(guān)系。,表

12、 急性毒性危害類(lèi)別和急性毒性估計(jì)值（LD50或LC50值）,GSH第3部分健康危害：關(guān)于急性毒性危險(xiǎn)類(lèi)別和標(biāo)簽要素，2003,表 中國(guó)食品毒理急性毒性分級(jí)法(1994),七、急性毒性替代試驗(yàn),第二節(jié) 局部刺激試驗(yàn)--眼刺激試驗(yàn)、皮膚刺激試驗(yàn)和皮膚致敏試驗(yàn),Local irritation test：目的：了解中藥對(duì)皮膚、眼睛的局部刺激性和腐蝕性 了解中藥對(duì)哺乳動(dòng)物是否可以引起皮膚變態(tài)反應(yīng)及其程度內(nèi)容：眼刺激

13、、皮膚刺激試驗(yàn)規(guī)定：外用、局部用藥和消毒劑均需做,一、眼刺激試驗(yàn),眼原發(fā)性刺激試驗(yàn)(eye primary irritayion test)觀察終點(diǎn)為眼刺激和眼腐蝕。眼刺激性(eye irritayion)：眼睛前表面接觸受試物后產(chǎn)生的眼睛可逆性炎癥變化眼腐蝕性(eye corrosion)眼睛前表面接觸受試物后產(chǎn)生的眼睛不可逆性組織損傷對(duì)皮膚產(chǎn)生刺激的強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性物質(zhì)可免做眼刺激試驗(yàn)對(duì)pH接近中性的大部分中藥，其對(duì)皮膚和眼的

14、刺激性反應(yīng)結(jié)果不一定有關(guān)系，應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行眼刺激試驗(yàn),Draize試驗(yàn)：方法：家兔4只，每兔一只眼滴入0.1ml受試物，另一只作為對(duì)照。滴入后可不沖洗，也可在滴入后不同時(shí)間(如4或30秒)沖洗。于滴眼24、48、72小時(shí)和4、7天時(shí)(必要時(shí)延長(zhǎng)到21天)，以肉眼或用手提式裂隙燈檢查后眼的反應(yīng)。觀察：結(jié)膜(發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物) 角膜(混濁程度和范圍) 虹膜(充血、腫脹和角膜周?chē)溲?標(biāo)準(zhǔn)：按規(guī)定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分

15、,評(píng)價(jià)：結(jié)果以主觀判斷為主，不同實(shí)驗(yàn)室間有差異?？蓪⒎磻?yīng)情況拍成彩照，以統(tǒng)一。 盡管結(jié)果有差異，但經(jīng)證實(shí)兔試驗(yàn)在檢測(cè)人的眼睛刺激性方面有效。 某些情況下家兔出現(xiàn)的刺激性反應(yīng)大于人,二、皮膚刺激試驗(yàn)(skin primary irritation test),內(nèi)容：?jiǎn)未魏投啻纹つw刺激試驗(yàn)，完整皮膚和破損皮膚試驗(yàn)觀察終點(diǎn)：皮膚刺激性和腐蝕性皮膚激性(dermal irritation

16、)：皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性的炎癥變化皮膚蝕性(dermal corrosion)皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部不可逆性組織損傷皮膚刺激的表現(xiàn)：水腫、紅斑,并非所有的中藥都適宜做皮膚刺激試驗(yàn)，可不做的3種情況為：①根據(jù)結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系及理化特性，推測(cè)可能有腐蝕性的物質(zhì)(如pH≦2或pH≧11.5)；②在急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)顯示有很強(qiáng)的系統(tǒng)毒性的物質(zhì)；③在急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)中給藥劑量達(dá)2000mg∕kg時(shí)仍未產(chǎn)生皮膚刺激體征的物質(zhì)

17、。,實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物：家兔、豚鼠(成年、健康、皮膚完好) 兔>豚鼠>大鼠>人>豬方法：至少4只，實(shí)驗(yàn)前24去除背脊柱兩側(cè)毛，范圍約3cm×3cm。24小時(shí)取受試物0.5ml(或0.5g)直接涂在皮膚上，用紗布及玻璃紙覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定，敷4小時(shí)(據(jù)人使用情況，可延長(zhǎng)到24小時(shí))，結(jié)束后溫水或無(wú)刺激性溶劑洗去殘留受試物。一只動(dòng)物脊柱兩側(cè)可備3個(gè)去毛區(qū)，進(jìn)行劑量-反應(yīng)研究，或

18、測(cè)試多種受試物。觀察：去除受試物后1、24、48小時(shí)觀察涂抹部位皮膚反應(yīng)，從無(wú)紅斑形成至有紫紅色斑并有焦痂，從無(wú)水腫至水腫隆起超過(guò)1mm，按嚴(yán)重程度評(píng)分。觀察時(shí)間的確定以足以觀察到可逆或不可逆刺激作用為準(zhǔn)，一般不超過(guò)14天。,影響因素：1)增加皮膚吸收的因素，如皮膚的完整性；2)固態(tài)受試物的物理特性，如邊緣鋒利的顆?；蜉^硬的纖維均可對(duì)皮膚產(chǎn)生機(jī)械刺激和原發(fā)性刺激反應(yīng)；3)固態(tài)受試物于干燥及溶解狀態(tài)下試驗(yàn)結(jié)果不同，溶解態(tài)作用增強(qiáng)；

19、4)如受試物可能用于人受損皮膚，則受試動(dòng)物皮膚也應(yīng)作用相似的處理；5)受試物在動(dòng)物皮膚表面封閉給藥的嚴(yán)密程度；6)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡與受試部位，隨著年齡增長(zhǎng)，皮膚敏感度降低。一般選用動(dòng)物背部皮膚(厚、不敏感)；7)性別不同，皮膚厚度及血流情況有差異；8)試驗(yàn)人員對(duì)判別標(biāo)準(zhǔn)的掌握。,破損皮膚制備：人為將動(dòng)物皮膚擦傷，不能傷及真皮產(chǎn)生出血(是否必要有爭(zhēng)議)評(píng)價(jià)：有時(shí)兔敏感性高于人，可產(chǎn)生假陽(yáng)性 刺激性較強(qiáng)中藥敏感性&

20、gt;刺激性弱者 替代：2009年歐盟將禁止用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)化妝品原料或成品 雞胚絨毛膜尿囊膜試驗(yàn)(HET-CAM) 雞胚絨毛膜尿囊膜苔盼藍(lán)染色試驗(yàn)(CAM-TBS) 熒光素漏出試驗(yàn)(FLT) 人工表皮模型,,三、皮膚致敏試驗(yàn)(skin sensitisation test),又稱(chēng)致敏性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis)： 一種對(duì)中藥免疫介導(dǎo)的皮膚反應(yīng)。

21、試驗(yàn)類(lèi)型： 福氏完全佐劑(FCA)法(提高動(dòng)物的敏感性)和不加佐劑法動(dòng)物：豚鼠方法：誘導(dǎo)接觸(induced exposure)以較低或中等濃度受試物對(duì)皮膚重復(fù)給藥(每天或每周4~5天，涂皮或皮下注射)，14天。激發(fā)階段，間隔10~14天后，用激發(fā)劑量(低于誘導(dǎo)劑量)處理未染過(guò)毒皮膚。觀察：24、48、72小時(shí)有無(wú)皮膚反應(yīng)，以反應(yīng)程度評(píng)分，比較、判斷。陽(yáng)性藥：通常需用陽(yáng)性對(duì)照組，用已知抗原物質(zhì)2,4-二硝基氯苯(DNCB)或 對(duì)

22、苯二胺等。,原理：中藥皮膚給藥產(chǎn)生較輕的反應(yīng)或無(wú)明顯反應(yīng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(幾周，甚至幾年)再次給藥，可引起遲發(fā)性超敏反應(yīng)(接觸性皮炎)，且在最初給藥部位以外的皮膚均可發(fā)生。在穿透皮膚的過(guò)程中，中藥作為半抗原，與體內(nèi)某些特定的載體蛋白共價(jià)結(jié)合，形成完全抗原，結(jié)合于表皮郞格罕細(xì)胞的細(xì)胞膜上或與巨噬細(xì)胞相結(jié)合，激發(fā)抗體形成及免疫記憶過(guò)程。郞格罕細(xì)胞表達(dá)免疫識(shí)別功能且在其細(xì)胞膜上有IgG和C3受體。這些細(xì)胞能吸附小分子且將它們代謝成更有活性的半抗

23、原性產(chǎn)物(超敏發(fā)生的皮膚部位郞格罕細(xì)胞增加)，此后再次接觸到同樣或相似的中藥質(zhì)，也能激發(fā)超敏反應(yīng)。皮膚敏反應(yīng)屬于Ⅳ型細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，由遲發(fā)性超敏反應(yīng)T淋巴細(xì)胞(TD)參與，反應(yīng)高峰在二次抗原接觸后24~48小時(shí)。,評(píng)價(jià)：1992年OECD化學(xué)品測(cè)試中，推薦使用豚鼠最大試驗(yàn)(GPMT)和不用佐劑的Buechler試驗(yàn)(BT，局部封閉敷貼法)。所有方法均不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)受試物對(duì)人類(lèi)的致敏性，得到的是外推的參考資料。在評(píng)價(jià)中，應(yīng)先進(jìn)行

24、合并使用佐劑的試驗(yàn)，如呈陽(yáng)性，再追加不使用佐劑的試驗(yàn)。,四、其他局部刺激試驗(yàn),根據(jù)人實(shí)際可能接觸途徑，如眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、皮膚、直腸、陰道、靜脈、動(dòng)脈、肌肉、皮下、靜脈旁和鞘內(nèi)等非口服途徑給藥，觀察用藥局部產(chǎn)生的毒性都應(yīng)進(jìn)行局部刺激性試驗(yàn)。 鼻黏膜、上呼吸道黏膜、直腸和陰道黏膜等試驗(yàn)，一般選用每組家兔3~4只或豚鼠、大鼠5~6只，設(shè)給藥組、陰性(溶劑或賦型劑)對(duì)照組及未處理組，通過(guò)上述途徑給藥至少4小時(shí)，24小時(shí)

25、后處死動(dòng)物，取出欲檢測(cè)的黏膜組織，觀察有無(wú)充血、紅腫現(xiàn)象，評(píng)價(jià)方法與皮膚刺激試驗(yàn)相同，還可觀察分泌物。若有變化，需進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，然后比較分析。,第三節(jié) 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn),一、長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的概念和目的急性毒性試驗(yàn)主要研究中藥急性毒性的特征和上限參數(shù)，而人類(lèi)接觸中藥往往是長(zhǎng)期反復(fù)的接觸，因此利用急性毒性試驗(yàn)難以預(yù)測(cè)慢性毒性。原因：長(zhǎng)期重復(fù)給藥時(shí)可產(chǎn)生與急性毒性試驗(yàn)完全不同的毒作用；隨著年齡的增長(zhǎng)動(dòng)物機(jī)體的健康和組織易感性不一樣。,

26、發(fā)生長(zhǎng)期毒性作用的基礎(chǔ)是蓄積作用吸收速度>代謝轉(zhuǎn)化和排泄→accumulation物質(zhì)蓄積(material accumulation)：重復(fù)多次接觸中藥后體內(nèi)可測(cè)出物質(zhì)的原形或代謝產(chǎn)物效應(yīng)蓄積或損傷蓄積(damage accumulation or effect accumulation)：長(zhǎng)期接觸后機(jī)體內(nèi)測(cè)不出中藥的原形或代謝產(chǎn)物，卻有慢性毒性作用。,試驗(yàn)?zāi)康模?、確定受試物重復(fù)給藥的毒效應(yīng)譜，毒作用特點(diǎn)。對(duì)在急性毒性

27、試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，并發(fā)現(xiàn)在急性毒性試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)的毒作用。2、研究長(zhǎng)期接觸受試物毒作用的靶器官。3、研究受試物重復(fù)接觸毒性作用的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)，提出受試物的安全限量參考。4、研究長(zhǎng)期接觸受試物毒性作用的可逆性。5、確定不同動(dòng)物物種對(duì)受試物長(zhǎng)期接觸毒性作用的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。,二、 試驗(yàn)方法,(一)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)

28、物的選擇1、品系：一般選擇兩種動(dòng)物：嚙齒類(lèi)(大鼠)、非嚙齒類(lèi)(犬)，經(jīng)皮毒性試驗(yàn)時(shí)，可用兔或豚鼠。2、性別：一般選用雌雄各半，如臨床只用于一種性別，可選用單性別動(dòng)物。3、年齡：慢性毒性試驗(yàn)的目的是使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命的大部分時(shí)間給藥受試物，因此在生命的早期開(kāi)始給藥很重要。FDA要求嚙齒類(lèi)在開(kāi)始時(shí)應(yīng)小于6周齡。一般6~8周齡大鼠(80~100g)，慢性可用剛離乳大鼠(50~70g)。4、動(dòng)物數(shù)：大鼠、小鼠每組不少于20只，犬、猴每組不少

29、于6只，如有中期處死觀察，動(dòng)物數(shù)相應(yīng)增加。5、微生物學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)和飼養(yǎng)環(huán)境：參照相關(guān)規(guī)定，如GLP：清潔級(jí)以上，屏障環(huán)境飼養(yǎng)。不同項(xiàng)目試驗(yàn)，分室進(jìn)行等,(二)給藥方式(或途徑)：原則：應(yīng)盡量與臨床給藥途徑一致。 一般以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮1)小動(dòng)物常用灌胃法和喂飼法：大鼠和小鼠建議用灌胃法，特別是在要求給藥量準(zhǔn)確較高的情況下。犬或猴可采用膠囊法或灌胃法。,2)經(jīng)呼吸道給藥：每日為2~6小時(shí) 給

30、藥柜中受試物濃度達(dá)到平衡后， 急性吸入：每天4小時(shí)； 長(zhǎng)期毒性依實(shí)驗(yàn)要求定，一般為6小時(shí) 3) 注射：有靜脈注射、靜脈點(diǎn)滴、肌肉注射和皮下注射。靜脈注射或點(diǎn)滴在長(zhǎng)期試驗(yàn)中實(shí)施困難，可用腹腔注射替代，注意無(wú)菌操作。4)每日給藥時(shí)間：保持一致。一般上午，給藥后喂飼。,(三)給藥期限：給藥頻率每日一次，連續(xù)給予。如試驗(yàn)期≥3個(gè)月，也可每周6次。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的期限：臨床擬用期限的2~3倍 如與致

31、癌試驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行則最好接近于動(dòng)物的預(yù)期生命。,(四)劑量設(shè)計(jì)和試驗(yàn)分組：至少3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性(溶媒)對(duì)照組組距2~10倍，最低不少于2倍，慢性毒性試驗(yàn)劑量組距應(yīng)小于亞慢性毒性試驗(yàn)。高劑量組：引起較明顯的毒性(低于10%死亡)中劑量組：觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)低劑量組：未觀察到有害作用劑量(NOAEL)劑量設(shè)計(jì)是關(guān)鍵也是比較困難：考慮：1)以相同物種的毒性資料作基礎(chǔ)。 可以急性毒性的閾劑量或者以L(fǎng)D

32、50的1∕5~∕20為最高劑量(同一品系動(dòng)物，同一給藥途徑)。,2)以動(dòng)物試驗(yàn)藥效學(xué)基礎(chǔ)確定最低劑組水平開(kāi)始設(shè)計(jì)。低劑量組原則上應(yīng)高于同一種動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)的有效劑量，并不使動(dòng)物出現(xiàn)毒性。在低劑量組水平之上，再設(shè)計(jì)中、高劑量組劑量水平。3) 采用人擬用的最高劑量為劑量設(shè)計(jì)依據(jù)。大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30、100倍，非嚙齒類(lèi)可用5、15、50倍。當(dāng)預(yù)期受試物沒(méi)有明顯毒性時(shí)，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)至少等于人擬用劑量的最大倍數(shù)，化學(xué)藥品為3

33、0倍，中藥為50倍。,(五)觀察指標(biāo)：1、活體評(píng)價(jià)(in-life evalution)(1)一般性指標(biāo) 外觀： 體表通道、毛色等 社會(huì)行為：躁動(dòng)、冷漠、探究 刺激性：好斗等 對(duì)周?chē)h(huán)境、代謝物、水的興趣 體重：低于對(duì)照組10%→毒效應(yīng) 有劑量-反應(yīng)關(guān)系→綜合毒性效應(yīng) 直接統(tǒng)計(jì)、增長(zhǎng)重量或增長(zhǎng)百分率統(tǒng)計(jì) 飼料消耗(攝食量)

34、：實(shí)際攝入量 食物利用率(每100g飼料體重增長(zhǎng)克數(shù)) 注意：有中毒反應(yīng)，取出單籠飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死應(yīng)及時(shí)尸檢,(2)實(shí)驗(yàn)室檢查：1)血液學(xué)指標(biāo)：RBC(計(jì)數(shù)、形態(tài)、比容、平均體積、平均血紅蛋白、平均血紅蛋白濃度)或網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類(lèi)、血小板計(jì)數(shù)(骨髓涂片) 凝血功能：凝血酶原時(shí)間PT、活化部分凝血活酶時(shí)間APTT(或替代方法)2

35、)血液生化學(xué)指標(biāo)：天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、堿性磷酸酶ALP、尿素氮BUN、總蛋白TP、白蛋白ALB、血糖GLU、總膽紅素T-BIL、肌酐Crea、總膽固醇T-CHO、(鈣、鉀、鈉)3)尿液分析：尿常規(guī)、外觀、體積、比重或滲透壓、PH、總蛋白質(zhì)、葡萄糖、(無(wú)機(jī)離子)4)心血管評(píng)估：非嚙齒類(lèi)動(dòng)物。標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)(右前左后)ECG，分析P-R、Q-T間期、心律、心率等，血壓5)眼科學(xué)檢查：嚙齒和非嚙齒類(lèi)。眼睛及其

36、毗連結(jié)構(gòu)。,(3)處死后評(píng)價(jià)(post-mortem evalution)：1) 尸體解剖：系統(tǒng)解剖，測(cè)定臟器重量，進(jìn)行肉眼和病理學(xué)檢查。稱(chēng)重并計(jì)算臟器系數(shù)：腦、心、肝、腎、腎上腺、胸腺、脾、睪丸、附睪、子宮、肺、甲狀腺臟器系數(shù)或臟器相對(duì)重量(relation organ weight)：某臟器濕重與體重之比值，通常是100g體重中所占重量。相對(duì)重量增加：可能有充血、水腫、腫瘤、增生或體重增長(zhǎng)受阻相對(duì)重量降低：壞死、萎縮等。

37、2)病理學(xué)檢查：包括試驗(yàn)過(guò)程中死亡的動(dòng)物均應(yīng)進(jìn)行仔細(xì)的肉眼觀察，可見(jiàn)的損傷或可疑損傷部位均應(yīng)采樣固定，作進(jìn)一步病理學(xué)檢查。對(duì)照組和高劑量組應(yīng)作病理學(xué)檢查，其他組取材保存，僅在高劑量組有異常時(shí)進(jìn)行檢查。,檢查內(nèi)容：嚙齒類(lèi)：腦(大腦、小腦、腦干)、脊髓(頸、胸、腰段)、垂體、視神經(jīng)、胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、唾液腺、胃、大腸、小腸、肝臟、胰腺、腎臟、腎上腺、脾臟、心臟、氣管、肺臟、主動(dòng)脈、睪丸、附睪、前列腺、子宮、卵巢、乳腺、膀胱、坐

38、骨神經(jīng)、骨髓、淋巴結(jié)(給藥局部、腸系膜)、給藥局部非嚙齒類(lèi)：+膽囊、眼(有異常時(shí))吸入性毒性：整個(gè)呼吸道，包括鼻腔、咽、喉、氣管、總支氣管、肺經(jīng)皮給藥：涂敷受試物部位皮膚和相鄰皮膚(4)可逆性觀察：最后一次給藥24小時(shí)，每組活殺部分動(dòng)物(2∕3)，余下動(dòng)物停止給藥，繼續(xù)觀察2~4周。,(5)指標(biāo)觀察時(shí)間：一般狀況每天觀察一次，每周記錄飼料消耗和體重一次。試驗(yàn)周期在3個(gè)月以?xún)?nèi)，一般在最后一次給藥后24小時(shí)和恢復(fù)期結(jié)束時(shí)各進(jìn)行

39、一次各項(xiàng)指標(biāo)的全面檢測(cè)。必要時(shí)，在試驗(yàn)中間檢測(cè)指標(biāo)一次。試驗(yàn)周期在3個(gè)月以上，應(yīng)在試驗(yàn)中期活殺少量動(dòng)物(高劑量組和對(duì)照組)檢測(cè)。,三、重復(fù)劑量毒理學(xué)試驗(yàn)的附加終點(diǎn),目的：最大限度利用動(dòng)物資源，減少危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)所用的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，并獲得附加資料。注意：謹(jǐn)慎選擇附加終點(diǎn)，保證有可靠的測(cè)量方法并獲得相應(yīng)機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。避免干擾研究主要目的。附加終點(diǎn)：遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性等,四、數(shù)據(jù)的處理和結(jié)果分析,(一)研究資料總匯(二)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較