醫(yī)械生物學評價實驗

1、醫(yī)療器械生物學評價試驗介紹,山東省醫(yī)療器械產品質量檢驗中心 生物學評價室王昕2017年10月,醫(yī)療器械生物學評價相關規(guī)章,國家食品藥品監(jiān)督管理總局2014年第43號《關于公布醫(yī)療器械注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》,醫(yī)療器械生物相容性評價研究,應對成品中與患者和使用者直接或間接接觸的材料的生物相容性進行評價。,生物相容性評價研究資料應當包括：,1.生物相容性評價的依據和方法。 2.產品所用材料的描述及與人體接觸的性質。

2、 3.實施或豁免生物學試驗的理由和論證。 4.對于現有數據或試驗結果的評價。,醫(yī)療器械生物學評價系列標準,GB/T16886.1-20部分GB/T16886.1風險管理過程中的評價與試驗,5,GB/T 16886 《醫(yī)療器械生物學評價》 系列標準,GB/T 16886 《醫(yī)療器械生物學評價》 系列標準,GB/T16886.18材料化學表征GB/T16886.19材料物理化學形態(tài)學和表面特性表征GB/T16886.20醫(yī)療器械免

3、疫毒理學試驗原則和方法,8,,依據GB/T16886/ISO10993系列標準基本原則制定了兩項醫(yī)療器械生物學試驗方法的國家標準：GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分：生物學試驗方法GB/T16175-2010醫(yī)用有機硅材料生物學評價試驗方法,1.基本評價試驗,細胞毒性---GB/T16886.5刺激或皮內反應（皮膚、 皮內、眼、口腔、陰道、直腸、陰莖）---GB/T16886.10致敏

4、---GB/T16886.10血液相容性（血栓、凝血、血小板、溶血、補體、血液學）---GB/T16886.4植入試驗（皮下、肌肉、骨）---GB/T16886.6 全身毒性（急性全身毒性、重復接觸全身毒性）---GB/T16886.11遺傳毒性(AEMS、染色體畸變試驗、小鼠淋巴瘤）---GB/T16886.3,2.補充評價試驗,（1）慢性毒性—口、吸入、經皮、靜脈、腹膜、植入途徑。 （2）致癌性。 （3）生殖和發(fā)育毒性。

5、 （4）生物降解—聚合物、金屬、合金、陶瓷。,醫(yī)療器械生物學試驗樣品制備,參考標準：GB/T16886.12-2005（ISO10993-12:2002)試驗樣品的選擇和制備標準化是保證生物學評價試驗結果可靠性和可比性的很關鍵的一步。在進行試驗以及解釋試驗結果時，應考慮器械在人體應用時的接觸性質、程度、頻率、時間和條件等因素，其中最關鍵的因素之一就是試驗樣品的制備。當制備器械浸提液時，所用的浸提介質和浸提條件應該既與最終產品的性

6、質和用途相適應，又要與試驗方法的可預見性（如試驗目的、原理、敏感性等）相適應。因此理想的浸提條件和試驗系統浸提液的應用既要反映產品的實際使用條件，還要反映試驗的目的和預測性。,醫(yī)療器械生物學試驗樣品的選擇,1. 應采用最終產品、最終產品中有代表性的樣品或與最終產品相同的工藝過程制得的材料以及它們的浸提液進行試驗。選擇的樣品必須被證明合理。2. 處置試驗樣品與參照樣品時應謹防污染。來自制造過程的任何殘留物應視為器械、器械部件或組件的構成

7、部分。（1） 試驗樣品如取自非無菌狀態(tài)，但要求使用前滅菌的器械，試驗樣品應按照制造廠家推薦的滅菌方法滅菌，必要時，試驗應采取無菌操作。（2）如果試驗樣品在滅菌前清洗，應考慮清洗過程和清洗劑對試驗樣品選擇和處置方面的影響。3．如果試驗過程要求無菌試驗樣品，應考慮滅菌或再滅菌過程對試驗樣品和參照材料的影響。4．當試驗樣品和參照材料需要分割成小片時，應考慮原先沒有暴露的表面（如腔或切面）的影響。,醫(yī)療器械生物學試驗樣品的選擇,6. 從

8、器械選擇有代表性的部分（1）如器械不能以整體用于試驗時，應選取最終產品中各種材料有代表性的部分按比例組合成試驗樣品。（2）有表面涂層器械的試驗樣品應包括涂層材料和基質材料，即使基質材料沒有和組織接觸。（3）與病人接觸的器械部件在制造過程中如使用了粘結劑、射頻密封或溶劑密封，試驗樣品則應包括粘接和/或密封處有代表性的部分。（4）復合材料應作為最終材料進行試驗。（5）當一個器械由不同的材料組成，在選擇試驗樣品時，應考慮其潛在的協同

9、作用和相互作用。（6）選擇的試驗樣品應能使器械組件最大限度地與試驗系統接觸，以了解潛在的生物學。,浸提條件和方法,浸提溫度浸提時間浸提比例浸提介質,浸提溫度和浸提時間,可采用下列的一個條件進行浸提：(37±1)℃，（72±2）h；(50±2)℃，（72±2）h；(70±2)℃，（24±2）h；(121±2)℃，（1±0.1）h；,注：,在多數

10、情況下為產品使用適宜的加嚴條件。對于細胞毒性試驗，含血清的細胞培養(yǎng)介質可在(37±1)℃，（24±2）h條件下浸提。采用高溫浸提時應注意：可能會導致聚合物的交聯和/或聚合作用增強； 可能會引起材料明顯出現降解。可降解材料浸提時要用適當的介質、時間、溫度條件來模擬盡可能的過度暴露。完全的溶解是適當的。,標準表面積和浸提液體積,,注：,標準的表面積包括樣品兩面和連接處的面積，不包括不確定表面的不規(guī)則面

11、積。當由于樣品外形不能確定其表面積時，浸提時可使用質量/體積。浸提之前應將材料切成小塊，以使材料浸沒在浸提介質中。 由于完整表面與切割表面存在潛在的浸提差異，因此對于彈性體、涂層材料、復合材料、層狀薄片等應盡量采用完整的樣品進行試驗。,浸提介質,浸提介質示例：極性介質：水、生理鹽水、無血清培養(yǎng)皿；非極性介質：各國藥典中規(guī)定的新鮮精制植物油（如棉籽油或芝麻油）；其余介質：乙醇/水、乙醇/生理鹽水、聚乙二醇400（稀釋至生理滲透壓

12、）、二甲基亞砜和含血清培養(yǎng)基。,浸提液制備的注意事項,浸提應在攪拌的條件下進行。當認為靜態(tài)適宜時，應對試驗方法加以論證、規(guī)定并出具報告。如可能, 液體浸提液應在制備后立即使用, 以防止吸附在浸提容器上或成分發(fā)生其他變化。不應調整浸提液的ph值除非給出理由。浸提液一般不應采用過濾、離心或其他方法來去除懸浮的粒子，如果必須進行時，應說明其理由。,浸提液制備的注意事項,對于在使用條件下不是可溶解和再吸收的材料和器械，進行浸提的任何溶劑不

13、應導致聚合物發(fā)生分解。聚合材料在揮發(fā)性溶劑中只應發(fā)生輕微變軟（如小于10%的溶解度）。如果器械是不能浸提的水狀液體，可用液體直接進行試驗。在正規(guī)使用條件下液體是在器械內循環(huán)，可以采用循環(huán)方式進行浸提，盡可能加大一個或多個實驗條件，如溫度、時間、體積、流速。選擇這種浸提方式的基本原理應該在報告中注明。,,細胞毒性試驗,細胞毒性試驗,現有版本是GB/T16886.5-2005（ISO10993-1999），GB/T16886.5-20x

14、x（ISO10993-2009）正在報批中。敏感性高、重現性好，結果有一定的臨床相關性，因此被廣泛地應用于醫(yī)療器械生物學評價中，特別是作為新材料篩選時的必做試驗。國內外無論哪項醫(yī)療器械生物學評價標準中都把細胞毒性試驗列為首位，作為首選項目。,概述,定義：該試驗采用已建立的細胞系（ATCC CCL1(NCTC clone 929)）, 測定由器械、材料和/或其浸提液造成的細胞溶解(細胞死亡)、以及對細胞生長的抑制和其他影響。意義：該試

15、驗屬體外試驗，能在短期內檢出供試品對細胞新陳代謝功能的影響，對毒性物質具有較高的敏感性，從而能快速篩選材料。因此，細胞毒性試驗為生物學試驗中首選試驗項目。,（一）評價類型簡介,醫(yī)療器械的細胞毒性可以有以下二種評價類型：1. 按不同生物學終點評價 (1) 細胞形態(tài)學評價：定性檢測方法，結果評價相對比較初淺，通常僅作為一種輔助或補充的方法。 (2) 細胞膜效應評價：中性紅染色法，臺盼蘭染色法，熒光素染色法等。

16、 (3) 細胞生長能力評價：細胞增殖度測定。 (4) 細胞代謝特性評價：ＭＴＴ法、各種測定細胞總蛋白量，蛋白質合成率和酶活性的方法。,,2. 按不同接觸方式評價 (1) 浸提液方式：將供試品浸在介質介質中，經過一定的時間和溫度的作用，取其浸提液與培養(yǎng)的細胞接觸。(2) 直接接觸方式：將供試品直接與培養(yǎng)的細胞接觸。(3) 間接接觸方式：將細胞與供試品隔開，在該體系中上層的供試品可以通過中間介質中的孔隙影響下層的細胞。包括瓊

17、脂擴散試驗、濾膜擴散試驗。,常用的細胞毒性試驗,MTT （四唑鹽）法：哺乳動物細胞的線粒體酶可將黃綠色的MTT降解形成藍紫色的物質，用二甲基亞砜（DMSO）將其溶解成溶液，用酶標儀測定其濃度，從而定量測定細胞的存活比例。該試驗用于細胞毒性定量評價。對該試驗有干擾的供試品不適于本試驗。,浸提方法,常用浸提方法舉例：按照4g/20ml浸提介質的比例，浸提介質為含血清的細胞培養(yǎng)基，（37±1）℃，（24±2）h。注意

18、：浸提液接觸細胞之前，如果進行過濾、離心等處理，應詳細記錄并對這些步驟加以說明。宜避免對浸提液進行處理，例如對pH值的調整，因為這會影響到試驗結果。,細胞毒性結果分析,定性評價：分級達到2級以上時被認為有細胞毒性效應。 定量評價： 細胞活性下降大于 30%被認為有細胞毒性反應。,細胞毒性結果評價,細胞毒性僅僅是一種最初的信號，它預示存在體內毒性的可能性，事實上單憑細胞毒性數據還未必能確定該器械一定不適用于特定的臨床應用在對細胞毒性的

19、結果評價時需要結合其他生物相容性數據和產品的預期用途進行綜合評價。在解釋試驗數據時還必須考慮到該試驗系統的局限性。,,刺激試驗,刺激是不涉及免疫學機制的一次、多次或持續(xù)與試驗材料接觸所引起的局部炎癥反應。要測定器械、材料及其潛在可溶出物的刺激作用，試驗的進行應與使用或接觸的途徑和持續(xù)時間相適應。刺激試驗具有較高的敏感性，是醫(yī)療器械三項基本生物學評價項目之一。,刺激試驗類型,皮膚刺激皮內反應特殊的刺激試驗：眼、口腔、陰莖、直腸和

20、陰道刺激等,注：,任何顯示為皮膚刺激物或pH≤2.0或≥11.5的材料也不宜再進行試驗，宜標示為潛在的眼刺激物。 任何已顯示為皮膚或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.5的材料不應再進行試驗，可標示為潛在的口腔、陰莖、直腸、陰道組織組織刺激物。任何顯示為皮膚、眼、黏膜組織刺激物的材料，或是pH≤2.0或≥11.5的材料，不應進行皮內試驗。,皮 內 反 應,試驗結果評價,對一些廣泛應用于人體正常或損傷皮膚的產品,一般不允許對皮膚有實

21、質性危害存在。在某些情況下，陽性試驗劑量不一定就判定材料不能使用。,致敏試驗,定義：免疫介導的對某種物質的皮膚反應。該試驗屬體內試驗，方法學相對比較成熟，靈敏性較高，因此為各類醫(yī)療器械必須評價的項目之一。,方法,最大劑量法封閉斑貼法小鼠局部淋巴結試驗（LLNA）,試驗結果評價,按本標準試驗步驟得出的試驗結果不能單獨成立。陰性試驗結果往往不能排除產品可能導致皮膚過敏反應的可能性。出現陽性試驗結果有時不一定就表明器械或材料不能使

22、用。,全身毒性試驗,急性全身毒性　亞急性全身毒性　亞慢性全身毒性　慢性毒性　熱原反應,,重復接觸全身毒性試驗,定義,急性全身毒性：在24h內一次、多次或持續(xù)接觸試驗樣品后在任何時間發(fā)生的不良作用。注：與藥典上的異常毒性試驗不同。亞急性全身毒性：在24h～28d內多次或持續(xù)接觸試驗樣品后發(fā)生的不良作用。亞慢性全身毒性：反復或持續(xù)接觸試驗樣品后在動物壽命期的某一階段發(fā)生的不良作用。慢性全身毒性：在動物的主要壽命期內反復或持續(xù)接

23、觸試驗樣品后發(fā)生的不良作用。,重復接觸全身毒性試驗,,,接觸途徑接觸劑量接觸時間,接觸途徑,GB/T 16886.11-2011中規(guī)定，醫(yī)療器械或其可瀝濾物可通過多種接觸途徑進入人體，亞慢性（亞急性）全身毒性試驗最好采用具有臨床相關性的接觸途徑，如采用其他接觸途徑應予以論證。接觸方式有皮膚、植入、吸入、皮內、肌內、腹腔、靜脈、經口、皮下等。,接觸劑量,對于較長期試驗，宜包括至少三種劑量水平和適當的對照組。采用一種適宜的試驗樣品劑

24、量進行單劑量組試驗可判定是否存在毒性危害（即限度試驗），但其他多劑量或劑量反應試驗要求多個劑量組來判定毒性反應。如準備采用加嚴劑量，可增加劑量組。,,劑量頻率：應具有臨床相關性。在重復接觸試驗中，試驗周期內動物最好每周7日接觸試驗樣品。劑量體積：GB/T 16886.11-2011中附錄B規(guī)定試驗樣品接觸最大劑量體積，但不應做為常規(guī)接觸劑量的選擇。,結果評價,觀察項目：體重變化、臨床觀察、臨床病理學、大體病理學、器官稱重、組織病理

25、學等。綜合分析各指標，判定是否具有“生物學相關性”。應注意此類試驗的局限性，對結果進行科學的判斷。,熱原試驗,致熱性是某種化學制劑或其他能產生發(fā)熱反應物質的一種特性。本部分所涉及的是材料介導的致熱性。常用方法是將材料浸提液由靜脈注入兔內，在一定時間內觀察兔體溫變化，以判斷在材料或浸提液中所含熱原量是否符合人體應用要求。只做該項試驗尚不能區(qū)分熱原反應是因材料本身還是因內毒素污染所致。只有同細菌內毒性試驗相結合才能做出熱原反應是否是

26、因材料致熱性所致。,,內毒素介導的致熱性這種致熱形式源自于革蘭氏陰性細菌的生物活性內毒素，通常為醫(yī)療器械制造過程中的誘導發(fā)熱的污染物，可采用特異性細菌內毒素試驗（鱟試劑法）測定器械內毒素含量來進行評價。材料介導的致熱性該類型致熱性為非內毒素相關因素引起，,,一般認為，熱原試驗主要適用于與循環(huán)血液接觸的器械。ASTM規(guī)定，與中樞神經系統和胸腔接觸的器械也要進行熱原試驗。注：熱原試驗是靜脈注射，需要考慮浸提液的狀態(tài)。,遺傳毒性,試

27、驗目的：使用哺乳動物或非哺乳動物細胞培養(yǎng)或其他技術來測定由醫(yī)療器械、材料和(或)其浸提液引起的基因突變、染色體結構和數量的改變，以及其他DNA或基因毒性。,遺傳毒性,實驗策略：優(yōu)先體外試驗，方案1：細菌基因突變試驗、哺乳動物細胞基因突變試驗、哺乳動物細胞誘導性試驗.方案2：細菌基因突變試驗、哺乳動物細胞基因突變試驗（覆蓋誘裂性和基因突變）。,遺傳毒性,實驗策略：如果體外試驗出現陽性，應進行體內誘變性試驗。常用體內試驗包括嚙齒動物微核試驗

28、、嚙齒動物骨髓中期分析、哺乳動物肝細胞程序外DNA合成試驗。,血液相容性,試驗目的：血液相容性試驗用一個相應的模型或系統評價與血液接觸的醫(yī)療器械或材料對血液或血液成分的作用。,血液相容性,試驗方法：血栓形成、凝血、血小板、血液學（溶血、白細胞計數、白細胞活化、網織紅細胞計數）、補體系統,血液相容性,溶血試驗： 供試品的溶血率應小于5% 。 血,生殖毒性試驗,試驗目的：評價試驗樣品對生殖功能、胚胎發(fā)育（致畸性）以及胎兒和早期嬰兒發(fā)育潛在影

29、響。,生殖毒性試驗,可能需要進行生殖及發(fā)育毒性試驗的材料或器械： 1. 與生殖組織或胚胎（胎兒）直接長期或永久接觸的器械。 2. 儲能醫(yī)療器械。 3. 可吸收材料或可溶出物質。（如在吸收、代謝和分布研究方面有充分可靠的數據，或者材料或醫(yī)療器械浸提液中鑒別出的所有成分均無生殖和發(fā)育毒性時，就無需進行試驗。,重點試驗,,60,內 容,,,植入后局部反應試驗,2,,細胞毒性的定義,根據歐洲標準化組織CEN1992年30號文件的定義,細胞毒性

30、是指由產品、材料及其浸提物所造成的細胞死亡、細胞溶解和細胞生長抑制。ISO10993.5-2009的定義： Cytotoxicity is an irreversible damage to living cells. 對活細胞不可逆的損害。,細胞毒性試驗是運用哺乳動物細胞體外培養(yǎng)技術，檢測醫(yī)療器械/材料引起的細胞生長抑制，溶解死亡等毒性作用。,體外細胞毒性試驗的特點,對毒物高度敏感。試驗周期短，可用于快速篩選。試驗

31、方法標準化，試驗結果重復性好，便于實驗室之間的結果比對。,體外細胞毒性試驗具有通用性, 廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評價。,ISO10993.5-2009,ISO 10993-5:2009和GB/T16886.5-2003(ISO 10993-5:1999)的區(qū)別,新標準修訂內容如下：修改了“材料浸提液的制備”、“試驗步驟”“結果評價”等相關內容，給出了細胞毒性定性和定量評價指標；—增加了“附錄A中性紅攝取(NRU)細胞毒性試驗”

32、；— 增加了“附錄B 集落形成細胞毒性試驗”；— 增加了“附錄C MTT細胞毒性試驗”；— 增加了“附錄D XTT細胞毒性試驗”。,細胞毒性測定中所使用的大量終點測定方法可分成以下評價類型： — 按形態(tài)學方法評定細胞損傷； — 細胞損傷的測定； — 細胞生長的測定； — 細胞代謝特性的測定。,ISO10993-5:2009術語和定義,近匯合 subconfluency 在對

33、數生長期末，約80%的細胞融合。 空白 blank 不含試驗樣品的浸提介質，浸提期間置于與試驗樣品相同的器皿中，并經受與試驗樣品相同的條件。,浸提液試驗,浸提液試驗結果的重現性穩(wěn)定。樣品與其他類似器械或材料的結果在實驗室內部和各實驗室間的水平上具有可比性。 浸提液試驗被普遍認可。,a) 含血清培養(yǎng)基;b) 生理鹽水溶液;c) 其他適宜的介質。

34、 含血清培養(yǎng)基是首選的浸提介質，優(yōu)先選用含血清培養(yǎng)基用于浸提是由于其具有支持細胞生長以及浸提極性和非極性兩種物質的能力。 除了含血清培養(yǎng)基，在明確要浸提極性物質（例如離子化合物）時宜考慮采用無血清培養(yǎng)基。其他適宜的介質包括水和二甲基亞砜（DMSO）。在所選擇的測試系統中, DMSO如高于0.5％（體積分數）時有細胞毒性。與含血清培養(yǎng)基浸提法相比，由于DMSO浸提液稀釋度較大，溶出物的細胞接觸濃度會比較低。,浸提介

35、質,含血清培養(yǎng)基按照a) （37±1）℃規(guī)定的浸提條件，因為浸提溫度超過（37±1）℃會對血清化學和/或血清穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中其他成分產生不良影響。 浸提液接觸細胞之前，如果進行過濾、離心或用其他方法處置，最終報告中對此應詳細記錄并對這些步驟加以說明，對浸提液pH值的調整也應在報告中說明。宜避免對浸提液進行處理，例如對pH值的調整，因為這會影響到試驗結果。,浸提條件,細胞系,優(yōu)先采用已建立的細胞系

36、并應從認可的貯源獲取。若貯存某一原種培養(yǎng)細胞系時, 則應將其放在相應培養(yǎng)基內, 在－80℃或－80℃以下凍存，培養(yǎng)基內加有低溫防護劑, 如二甲基亞砜或甘油。長期貯存（數月至數年）只能在－130℃或－130℃以下凍存。,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基應無菌。含血清或無血清培養(yǎng)基應符合選定細胞系的生長要求。培養(yǎng)基中可含有對試驗無不良作用的抗生素。,原種培養(yǎng)細胞制備,用選定的細胞系和培養(yǎng)基制備試驗所需的細胞。使用存儲細胞時, 如加有低溫防護劑要除去,

37、 使用前至少傳代培養(yǎng)一次。 傳代培養(yǎng)細胞時, 采用適合細胞系的酶分散法和/或機械分散法。,試驗步驟,平行樣數 應至少采用三個平行試驗樣品數和對照品數。 浸提液試驗 本試驗用于細胞毒性定性和定量評定。試驗宜在近匯合單層細胞或新鮮懸浮細胞上進行。 試驗開始前用顯微鏡驗證培養(yǎng)細胞的近匯合和形態(tài)學情況。經過至少24h的培養(yǎng)后，確定細胞毒性反應。,細胞毒性的測定,可采用定性或定量方法測定細胞毒性反應。

38、定性評價: 用顯微鏡檢查細胞，必要時采用細胞化學染色，評價諸如一般形態(tài)、空泡形成、脫落、 細胞溶解和胞膜完整性等方面的改變。在試驗報告中應描述性地或以數字記錄正常形態(tài)的變化，表1給出了用于對試驗樣品分級的方法。,表1 浸提液細胞毒性形態(tài)學定性分級,正常開始,正常中間,正常結束,正常細胞,給毒后的細胞形態(tài)：,陰性對照,空白對照,陽性對照,四級結果,浸提液試驗的定量評價,定量評價: 測定細胞死亡、細胞生長抑制、細胞增殖或克隆形成?？梢杂每陀^

39、的方法對細胞數量、蛋白總量、酶的釋放、活體染料的釋放、活體染料的還原或其他可測定的參數進行定量測試。試驗報告中應記錄使用的方法和反應。ISO10993-5：2009規(guī)定細胞活性下降大于 30%被認為有細胞毒性反應。,ISO10993-5 ：2009附錄C（資料性附錄） MTT 細胞毒性試驗,原理 通過細胞代謝活性測定細胞的存活率。 MTT黃色水溶液 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diph

40、enyltetrazoliumbromid)在活細胞內代謝性減少，生成藍紫色不可溶的甲瓚。甲瓚溶于異丙醇后用分光光度計測定的色度與活細胞數目相關。,試驗步驟,基本步驟 L929細胞接種至96孔板，維持培養(yǎng)24h（～1倍周期），至形成半匯合單層。然后與系列濃度試驗化合物接觸。接觸24h后測定每一試驗濃度甲瓚形成，與對照培養(yǎng)細胞的甲瓚形成進行比較。計算每一試驗濃度生長抑制百分比。,材料,試驗用細胞系采用L929細胞(NCTC clone

41、 929: CCL 1, American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA, USA; ECACC No. 88102702, European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)，試驗用細胞應無支原體感染。,試驗質量檢查（Ⅰ）:陽性對照(PC)和陰性對照(NC),,試驗質量檢查（Ⅱ）：空白

42、,未經處理空白的光密度（OD570）絕對值可表明，在試驗的兩天內以每孔1×104接種的細胞是否以正常的倍增時間以指數方式增長?？瞻譕D570平均值如≥0.2，則試驗符合接受標準。為了檢查細胞接種系統誤差，將空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）兩側。左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，則試驗符合接受標準。對于細胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細胞數量一致。采用顯微鏡評

43、價則可免除兩列空白的操作。,MTT細胞毒性試驗操作流程,數據記錄,試驗樣品（100%浸提液）組試驗細胞存活率下降至如<空白組試驗細胞存活率的70%，則具有潛在的細胞毒性。,ISO10993-5：2009附錄D（資料性附錄） XTT細胞毒性試驗,原理通過線粒體脫氫酶的測定反應細胞的存活率。XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]

44、 -2H-tetrazolium hydroxide)與線粒體脫氫酶反應，生成水溶性甲瓚。用分光光度計測定的色度與活細胞數目相關。,細胞系采用L929細胞(NCTC clone 929: CCL 1, American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA, USA; ECACC No. 88102702, European Collection of Cell Cultures,

45、Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)，細胞培養(yǎng)物應無支原體。,試驗質量檢查（Ⅰ）:陽性對照(PC)和陰性對照(NC),每項細胞毒性試驗都包括陽性對照和陰性對照。,試驗質量檢查（Ⅱ）：空白,未經處理空白的光密度（OD450）絕對值可表明，在試驗的兩天內以每孔1×104接種的細胞是否以正常的倍增時間以指數方式增長?？瞻譕D450平均值如≥0.2，則試驗符合接受標準。為了檢查細胞接種系統誤差，將空白

46、加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）兩側.左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，則試驗符合接受標準。對于細胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細胞數量一致。采用顯微鏡評價則可免除兩列空白的操作。,XTT細胞毒性試驗操作流程,數據分析,活細胞數減少是由于樣品中線粒體脫氫酶總活性降低，這直接與生成的橙色甲瓚量有關，在450nm測量光密度。與空白比較計算存活率下降情況。,數據記錄,試驗樣品（10

47、0%浸提液）組試驗細胞存活率下降至如<空白組試驗細胞存活率的70%，則具有潛在的細胞毒性。,ISO10993.5-2009附錄A（資料性附錄）中性紅攝取(NRU)細胞毒性試驗,概述將BALB/c 3T3細胞接種至96孔平板內并維持培養(yǎng)24h（～1倍周期），至形成半匯合單層。然后與系列濃度的試驗混合物接觸，24h后測定每一試驗濃度的NRU并與對照培養(yǎng)細胞測定進行比較。,BALB/c 3T3細胞、clone 31（如ECACC86

48、110401，European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK；CCL-163，American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA, USA) 和從CCL-163[ATCC]制備的JCRB 9005（Human Science Research Resources Bank, Osaka,

49、Japan）。,細胞系,試驗質量檢查（Ⅰ）:陽性對照(PC),細胞毒性試驗應包括陽性對照。多數化學物有歷史資料或實驗室內、實驗室間重復試驗的支持，十二烷基硫酸鈉（SLS,CAS # 151-21-3）即是最經常用于試驗的一種化學物，因此推薦作為陽性對照。在使用SLS時推薦四個濃度標度：0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL。SLS的IC50歷史平均值(Spielmann et. al., 1991

50、 [10])為0.093mg/mL。95%置信區(qū)間為0.070mg/mL至0.116mg/mLSLS的IC50如在95%置信區(qū)間，則試驗符合標準。推薦使用陽性參照材料和陰性參照材料,試驗質量檢查（Ⅱ）：空白,未經處理空白的光密度（OD540）絕對值可表明，在試驗的兩天內以每孔1×104接種的細胞是否以正常的倍增時間以指數方式增長?？瞻譕D540平均值如≥0.3，則試驗符合接受標準。為了檢查細胞接種系統誤差，將空白加到

51、96孔板的左（第2列）、右（第11列）兩側。左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，則試驗符合接受標準。對于細胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細胞數量一致。采用顯微鏡評價則可免除兩列空白的操作。,試驗質量檢查（Ⅲ）：濃度-反應質量檢查,由濃度-反應得出的IC50宜至少有兩個或三個（NRU抑制率在10%和90%之間的反應作為支撐。否則，濃度稀釋因子可能易于降低，放棄該試驗并采用較小的稀釋因子重復

52、試驗。,3T3NRU細胞毒性試驗操作流程,樣品浸提液最高濃度（100%浸提液）的細胞相對活性如≥對照組的70%，材料應被認為無細胞毒性。浸提液如顯示細胞毒性反應，計算每一試驗濃度（即試驗化學物濃度）的生長抑制率。從濃度反應計算IC50（即產生50%NRU還原的濃度），以浸提液稀釋百分比表示。浸提原液為100%浸提液。,數據分析,ISO10993-5：2009附錄B（資料性附錄）集落形成細胞毒性試驗,試驗概述將V79細胞加到6孔板中

53、，保持培養(yǎng)24h至開始對數生長階段。然后與系列濃度的試驗物接觸，孵育6天，于集落較大時計數。用甲醇固定集落，吉姆薩液染色并計數。,細胞系,V79細胞（JCRB 0603, Human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan；或美國和歐洲細胞庫的其他細胞）注：推薦使用V79細胞，因為其能形成大并清晰的集落。,試驗質量檢查（Ⅰ）:陽性對照(PC)陰性材料 (NC),細胞毒性試驗應包括陽性

54、對照和陰性對照。如ZDEC和ZDBC。ZDEC的IC50宜不超過7%。ZDBC的IC50宜不超過80%。,試驗質量檢查（Ⅱ）：空白,空白集落平均數如至少為細胞板每孔細胞數目的70%，則試驗符合接受標準。,試驗質量檢查（Ⅲ）：濃度-反應質量檢查,由濃度-反應得出的IC50宜至少有兩個或三個對照抑制率在10%和90%之間的反應作為支撐。否則，濃度稀釋因子可能易于降低，放棄該試驗并采用較小的稀釋因子重復試驗。,試驗步驟,注意：原種細胞解

55、凍后，細胞在用于試驗之前要傳代2～3次。第1天 用MEM05培養(yǎng)基制備33.3個細胞/mL的細胞懸液。6孔板的每孔加入3mL細胞懸液。第2天 孵育24h后從每孔中吸出培養(yǎng)基。加入2mL用MEM05培養(yǎng)基制備的100%浸提液或稀釋浸提液。每一濃度平行制備3孔。置培養(yǎng)箱再孵育6天。第8天 從每孔中吸出培養(yǎng)基，用PBS沖洗每一孔，加入甲醇固定集落，再用5%吉姆薩液染色。計算每一孔集落數目。,結果表示,集落形成細胞毒性試

56、驗平板效率如≥對照組的70%，材料應被認為無細胞毒性。浸提液如對細胞顯示細胞毒性作用，計算IC50(濃度抑制率至50%)，以浸提液百分比表示。注：平板效率：對照組集落數目除以浸提液組集落數目，以百分數表示系數。,直接接觸試驗,本試驗用于細胞毒性定性和定量評價。 在每只器皿中央部位的細胞層上各小心地放置一個試驗樣品的試樣, 確保試樣覆蓋細胞層表面約十分之一。 適當的培養(yǎng)周期（最少24h ）。按表2確定細胞毒性反應。,間接接觸試驗

57、-瓊脂擴散試驗,本試驗用于細胞毒性定性評價。不適用于不能通過瓊脂層擴散或可能與瓊脂相互作用的可瀝濾物。 將試驗樣品的試樣小心地放在每只器皿的固化瓊脂層上, 確保試樣覆蓋細胞層表面約十分之一。適當的培養(yǎng)周期（培養(yǎng)24h～72h）。按表2確定細胞毒性反應。,間接接觸試驗-濾膜擴散試驗,本試驗用于細胞毒性定性評價?？讖?.45μm、無表面活性劑的濾膜 。 將試驗樣品的試樣小心地放到濾膜無細胞面的上面。濾膜上放置不產生反應的環(huán), 用

58、以保留浸提液和新加入的混合物。 適當的培養(yǎng)周期（培養(yǎng)2h±10min ）。按表2確定細胞毒性反應。,表2瓊脂和濾膜擴散試驗及直接接觸試驗反應分級,植入后局部反應試驗,ISO 10993-6:2007和GB/T16886.6-1997（ISO 10993-6:1994）的區(qū)別： 新標準修訂內容如下：修改了“范圍”， 適用范圍增加可降解和/或可吸收性材料；修改了“植入試驗方法通則”、“評價和試驗報告”、“肌肉植入中

59、植入樣品的數量”等相關內容；增加了“試驗方法的基本方面”；增加了“附錄A 可降解/可吸收性材料植入周期和組織反應的基本考慮”；增加了“附錄E 植入后局部生物學反應評價舉例”。,概述,植入后局部反應試驗是把醫(yī)療器械材料植入實驗動物肌肉，皮下組織，骨組織中，在一定周期后，通過肉眼觀察和顯微技術評價植入部位和周圍組織反應情況，樣品對活體組織的局部毒性作用。,可能需要進行植入試驗的樣品,（一）組織反應的基本過程,1 炎癥期：以炎癥細胞滲出

60、和浸潤為主，（1）早期主要以中性粒細胞和淋巴細胞為主；（2）后期出現以淋巴細胞、單核細胞（巨噬細胞）、漿細胞為主的反應--細胞成分可因材料的不同而不同。一般2-4周炎癥反應最強，以后逐漸減弱，3個月后炎癥反應應基本消失。例如：纖維蛋白膠：漿細胞和嗜酸粒細胞；膠原蛋白材料：淋巴細胞和異物細胞；,,2 纖維組織化期： 在炎癥期的炎癥反應外側出現纖維母細胞為主的肉芽組織，隨著炎癥反應的消退，以及纖維細胞增生和分泌膠原纖維

61、，纖維細胞逐漸減少，最終被纖維組織形成的包囊包裹。,（二）植入部位,試驗樣品應植入與材料臨床應用最相關的組織 ：1）肌肉植入2）皮下植入3）骨植入4）特殊部位植入,植入方式,肌肉植入皮下組織植入骨植入,肌肉植入,皮下植入,骨植入,肌肉植入試驗,把一定大小形狀的試驗樣品植入實驗動物的肌肉組織，同樣植入標準對照材料，對照材料是 已確立臨床可接收性和生物相容性良好的同類樣品材料。定期采集標本和周圍組織，肉眼和顯微鏡下比較觀察試驗樣

62、品和對照材料引起的組織生物學反應。,皮下組織植入試驗,用于評定皮下組織對植入材料的生物學反應。對試驗樣品植入物與對照樣品植入物的生物學反應進行比較，對照材料是已確立臨床可接受性和生物相容性的醫(yī)療器械所采用的材料。,骨植入試驗,把植入物插入實驗動物的骨組織內，對試驗樣品植入物與對照樣品植入物的生物學反應進行比較，對照材料是 已確立臨床可接收性和生物相容性良好的同類樣品材料。,實驗動物,實驗用兔被普遍選用。對于短期試驗，通常使用嚙齒動物或

63、家兔。對于長期試驗，嚙齒動物、家兔、犬、綿羊、山羊、豬及其他平均壽命相對較長的動物比較適宜。,（三）樣品制備,應根據最終產品預期所用方法對每個植入樣品進行制造、處理、污染物的清洗和滅菌，并應在研究文件中進行確認。,皮下植入樣品制備,樣品狀態(tài)a) 薄片材料應制成直徑10mm～12mm、厚度0.3mm～1.0mm的試驗樣品。b) 塊狀材料應制成直徑1.5mm、長5mm、兩端為圓頭的試驗樣品。c) 非固體試驗樣品（包括粉劑）應裝入直徑1

64、.5mm、長5mm的導管內。樣品數量：每種材料和每一植入期至少采用3只動物和足夠的植入部位，總數達到10個試驗樣品和10個對照樣品。,肌肉植入樣品制備,樣品狀態(tài)： 寬1mm～3mm、長度約10mm 較大樣品：直徑10mm、厚度3mm 樣品應制成圓形邊緣，兩端拋光至純圓半徑。樣品數量： 每一植入期至少采用3只動物和足夠的植入部位，總數達到10個試驗樣品和10個對照樣品。,骨植入樣品制備,樣品狀態(tài)：家兔：直徑2mm、

65、長6mm的圓柱體樣品數量：每一植入期應評價至少10個試驗樣品和10個對照樣品。,（四）試驗周期,試驗周期應根據臨床可能接觸時間來確定，或是持續(xù)至相應生物學反應達到或超過某一穩(wěn)定狀態(tài)。選擇的時間點應進行說明和論證。非降解、非吸收性材料：1）短期反應：1周到4周；2）長期反應：12周以上。,結論,結論：在本試驗下列情況下，試驗樣品判定為：—無刺激（0.0～2.9）—輕微刺激（3.0～8.9）—中度刺激（9.0～15.0）—

66、重度刺激（>15）與陰性對照樣品比較組織反應。,生物降解試驗,參考標準：GB/T16886.6試驗周期應與植入部位、植入物的尺寸、估計的降解時間相關。,可降解/可吸收性材料植入周期和組織反應的基本考慮,應對植入物各時間點與降解過程相關的局部組織反應進行評價（不推薦單一的植入時間點）：a)發(fā)生降解時；b)中期降解階段；c)達到穩(wěn)定狀態(tài)時，組織恢復或接近完全降解（一般需要達到或超過吸收終點，即完成預期的重塑和修復的最終組織

67、反應或生物反應恢復至正常組織學）。,刺激與皮膚致敏試驗,,ISO 10993-10:2010和GB/T16886.10-2005(ISO 10993-10:2002)的區(qū)別,新標準修訂內容如下：修改了標準名稱；修改了術語和定義；取消了原“5.4材料鑒別”；皮內反應試驗由附錄B調整到正文中；人體皮膚刺激試驗方法由正文調整到附錄C；皮膚致敏試驗增加小鼠局部淋巴結檢驗法；增加了附錄D體外皮膚刺激試驗；增加了附錄E聚合物試驗材料

68、浸提液制備方法。,皮膚致敏試驗,,概念,皮膚致敏 skin sensitization變應性接觸性皮炎。免疫介導的對某種物質的皮膚反應。是一種免疫應答反應。,目前三種測定化學物潛在皮膚致敏性的動物試驗,最大劑量致敏試驗(GPMT)封閉式貼敷試驗(Buehler試驗)小鼠局部淋巴結試驗（LLNA）,,皮膚致敏試驗,GPMT,BT,LLNA,皮膚評分,,,,,致敏性評價,,BrDU,淋巴細胞分析,,,,皮膚致敏試驗,豚鼠最大