紫色達(dá)利菊提取縮合單寧對(duì)大腸桿菌和瘤胃氮代謝以及瘤胃微生物的影響.pdf

1、紫色達(dá)利菊(Petalostemun purpureum)是一種適應(yīng)性極強(qiáng),適口性較好,并廣泛分布于北美草原上的一種豆科植物。紫色達(dá)利菊含有較高的縮合單寧并具有極強(qiáng)的抗致病性大腸桿菌的能力。但關(guān)于其縮合單寧對(duì)大腸桿菌的抑菌活性及可能機(jī)制,是否具有保護(hù)植物蛋白過(guò)瘤胃的作用以及對(duì)瘤胃微生物的影響并不清楚。因此,設(shè)計(jì)三個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究紫色達(dá)利菊縮合單寧對(duì)反芻動(dòng)物的影響:
　　 實(shí)驗(yàn)一、紫色達(dá)利菊所含縮合單寧對(duì)肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作

2、用機(jī)理。
　　 在致病性大腸桿菌O157:H7的體外培養(yǎng)基中加入十一種不同植物縮合單寧(添加量:400μg/ml),結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅紫色達(dá)利菊所含縮合單寧表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗致病性大腸桿菌O157:H7生物活性。同時(shí),在厭氧條件下添加200μg/ml該縮合單寧表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌(ATCC25922)的抑制作用。穿透電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞膜在縮合單寧的作用下增厚,掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加較高濃度縮合單寧時(shí),大腸桿菌菌體表面被一層膜外

3、物質(zhì)包裹。大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性在200μg/ml縮合單寧添加量下顯著降低。為進(jìn)一步確定紫色達(dá)利菊所含縮合單寧對(duì)反芻動(dòng)物后腸消化及后腸大腸桿菌的影響,分別在2009和2010年進(jìn)行放牧試驗(yàn),試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),處理為對(duì)照組(不含紫色達(dá)利菊以雀麥草為主的草地),試驗(yàn)組Ⅰ(以紫色達(dá)利菊與雀麥草為主的草地)和試驗(yàn)組Ⅱ(以紫色達(dá)利菊與針茅草和雀麥草混合的草地)。于2009和2010年夏季和秋季在試驗(yàn)地采集植物樣品和糞樣,用于分析植物和糞樣的化

4、學(xué)成分及糞樣中的大腸桿菌數(shù)量。縮合單寧含量在試驗(yàn)組Ⅰ和Ⅱ顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。試驗(yàn)組Ⅰ和Ⅱ動(dòng)物糞樣中大腸桿菌的數(shù)量在2009年秋季和2010年夏秋季放牧中顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。秋季放牧中,對(duì)照組糞樣pH、總氮、有機(jī)物消化率、氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ和Ⅱ而乙酸/丙酸低于對(duì)照組(P＜0.05)。夏季放牧動(dòng)物糞樣各指標(biāo)差異不顯著。因此,紫色達(dá)利菊所含縮合單寧可能通過(guò)改變大腸桿菌細(xì)胞膜或與細(xì)胞膜相互作用來(lái)抑制大腸

5、桿菌的生長(zhǎng),從而減少肉牛糞便中的大腸桿菌數(shù)量。
　　 實(shí)驗(yàn)二、紫色達(dá)利菊及其與禾本科和豆科牧草混合氮代謝規(guī)律的研究。
　　 為確定紫色達(dá)利菊中縮合單寧的分布和體外瘤胃降解率,分別在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和盛花期采集整株植物,測(cè)定葉、莖和花所占的比例以及總酚,可提取單寧、蛋白結(jié)合單寧和纖維結(jié)合單寧的含量?；ㄖ锌偪s合單寧的含量顯著高于莖和葉的含量(P＜0.05)。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期葉中的總酚和總縮合單寧都高于盛花期。紫色達(dá)利菊不同部位可提取單寧

6、的量遠(yuǎn)高于蛋白結(jié)合單寧和纖維結(jié)合單寧。盛花期整株植物縮合單寧含量高于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期(P＜0.001)。體外試驗(yàn)采用2×2析因試驗(yàn)設(shè)計(jì),將不同草地采集的兩期植物放入三套DAISYII發(fā)酵器中,同時(shí)每個(gè)發(fā)酵器中的兩個(gè)發(fā)酵罐添加聚乙二醇(單寧活性抑制劑),分別在0,1,2,4,8,12,24,48和72h取樣。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期具有較高的真干物質(zhì)和真氮消化率,同時(shí)干物質(zhì)和氮素中潛在降解部分(6)均高于盛花期。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期干物質(zhì)中快速降解部分(α)要高于盛花

7、期(P＜0.001),而氮素中的快速降解部分卻低于盛花期(P＜0.01)。添加聚乙二醇后,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期干物質(zhì)的慢速降解部分速率常數(shù)(C)增加(P＜0.01)但對(duì)盛花期無(wú)影響。添加聚乙二醇增加盛花期真氮素潛在降解部分,對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期無(wú)影響。兩期紫色達(dá)利菊體外12h殘留飼料δ15N的含量在添加聚乙二醇后顯著增加(P＜0.01)。這表明紫色達(dá)利菊在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期擁有較高的瘤胃消化率而在盛花期其縮合單寧對(duì)氮素的消化率有一定影響,同時(shí)兩期植物所含縮合單寧

8、均在消化過(guò)程中對(duì)微生物的附著有一定影響。但總的來(lái)看,高縮合單寧對(duì)紫色達(dá)利菊真干物質(zhì)和真氮的消化率影響不大。
　　 為確認(rèn)紫色達(dá)利菊與冷季禾本科植物混合對(duì)瘤胃發(fā)酵和菌體蛋白合成的影響。測(cè)定了紫色達(dá)利菊與混合冷季植物樣品(冷季植物以雀麥草為主),并用縮合單寧含量在7,14,29和42g/kgDM的樣品進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)采用4×2析因試驗(yàn)設(shè)計(jì),重復(fù)兩次。δ15N硫酸氨用來(lái)測(cè)定菌體蛋白合成效率。添加聚乙二醇并未對(duì)最大產(chǎn)氣量以及延遲期

9、產(chǎn)生影響,但能夠增加產(chǎn)氣率(P＜0.01)。隨著紫色達(dá)利菊含量的增加,12和48h體外真干物質(zhì)消化率均有所提高(P＜0.01)但菌體蛋白產(chǎn)量在12h有所下降(P＜0.01)。添加聚乙二醇增加12h真干物質(zhì)消化率(P＜0.01)。隨著縮合單寧含量的增加,添加聚乙二醇增加氨態(tài)氮和支鏈揮發(fā)性脂肪酸的含量并降低菌體蛋白的合成效率(P＜0.01)。這表明冷季植物中混合紫色達(dá)利菊能夠增加瘤胃降解率。含量為4.2％的縮合單寧對(duì)干物質(zhì)降解率無(wú)影響但能增

10、加菌體蛋白合成效率。
　　 為了確定紫色達(dá)利菊所含縮合單寧對(duì)保護(hù)豆科植物蛋白不被微生物降解成氨態(tài)氮的能力,同時(shí)確定對(duì)甲烷氣體產(chǎn)量以及瘤胃微生物的影響。試驗(yàn)采用5×2析因試驗(yàn)設(shè)計(jì),用含δ15N標(biāo)記的苜蓿與紫色達(dá)利菊組成五個(gè)比例:100:0、75:0、50:50、25:75和0:100,同時(shí)添加或不添加聚乙二醇,重復(fù)三次。利用Ammoniaδ15Ndiffusion技術(shù)和Real-timePCR測(cè)定苜蓿蛋白向氨態(tài)氮中的轉(zhuǎn)化效率和微生

11、物的菌體拷貝數(shù)。隨著紫色達(dá)利菊比例的增加,添加聚乙二醇能夠顯著提高氨態(tài)氮和氨態(tài)氮中δ15N含量以及苜蓿δ15N向氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化效率(P＜0.01)。添加聚乙二醇對(duì)48h內(nèi)消耗單位干物質(zhì)的甲烷氣體產(chǎn)量無(wú)影響。12h時(shí),三種纖維降解菌,產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌,瘤胃白球菌和瘤胃黃球菌隨著紫色達(dá)利菊的比例增加而降低但差異不顯著。非纖維降解菌中甲烷菌,瘤胃鏈球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的拷貝數(shù)同樣隨著紫色達(dá)利菊的比例增加而降低但差異不顯著。這表明,縮合單寧能夠減

12、少瘤胃發(fā)酵氨態(tài)氮的濃度,同時(shí)減少混合苜蓿氮向氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化,從而保護(hù)苜蓿中的氮不以氨態(tài)氮的形式損失。
　　 實(shí)驗(yàn)三、縮合單寧對(duì)主要瘤胃微生物的影響以及微生物對(duì)縮合單寧的適應(yīng)性
　　 微生物純培養(yǎng)試驗(yàn)選用3種纖維降解菌并在含縮合單寧O和25μg/ml培養(yǎng)液中以纖維素為底物,在試驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)21天,然后在含縮合單寧0、75、150、300和450μg/ml中進(jìn)行濾紙消化試驗(yàn)。同時(shí)選用四種非纖維降解菌在含縮合單寧0和50μg/m

13、l中培養(yǎng)并適應(yīng)15天,然后添加0、100、200、400和600μg/ml縮合單寧并測(cè)定生長(zhǎng)曲線。當(dāng)縮合單寧含量為75μg/ml時(shí),降低產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌,瘤胃白球菌和瘤胃黃球菌的濾紙消化率(P＜0.01)。掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)縮合單寧含量高于150μg/ml時(shí),纖維降解菌停止生長(zhǎng),纖維表面出現(xiàn)大量絮狀物質(zhì)。而非纖維降解菌中,瘤胃普雷沃氏菌,嗜淀粉瘤胃桿菌以及瘤胃鏈球菌對(duì)縮合單寧比較敏感,在含量為200μg/ml即顯著改變其生長(zhǎng)曲線,而

14、反芻動(dòng)物半月形單胞菌在縮合單寧含量為600μg/ml仍能較好的生長(zhǎng)。試驗(yàn)選用三種纖維降解菌和四種非纖維降解菌均未表現(xiàn)出對(duì)縮合單寧的適應(yīng)性。因此,高劑量縮合單寧對(duì)瘤胃微生物有抑制作用并影響纖維降解菌的附著。
　　 綜上所述,紫色達(dá)利菊是一種高縮合單寧、高蛋白的豆科植物,其縮合單寧能夠通過(guò)與細(xì)胞膜相互作用抑制大腸桿菌,并能夠降低反芻動(dòng)物后腸大腸桿菌的數(shù)量。同時(shí),紫色達(dá)利菊與其它冷季草地植物混合后能夠提高真干物質(zhì)消化率。紫色達(dá)利菊與苜