淋巴細(xì)胞分離描述

1、免疫細(xì)胞分離和保存技術(shù),意義臨床上的各種類型的免疫缺陷、自身免疫病以及腫瘤等疾病均可出現(xiàn)淋巴細(xì)胞或淋巴亞群的數(shù)量和功能的變化。因此用體外方法對機(jī)體具有免疫反應(yīng)的外周血淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)目或比例以及它們所顯示的功能的強(qiáng)弱進(jìn)行檢測，是判斷機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一種重要手段。這對于臨床認(rèn)識疾病、探討其發(fā)病機(jī)制、觀察病情變化、判斷預(yù)后、考核療效和防治疾病等方面均有重要意義。要求分離的淋巴細(xì)胞純度高、產(chǎn)量多，而且不喪失活性，同時(shí)也要求分

2、離技術(shù)簡單、操作方便。,,細(xì)胞分離基本原理,不同細(xì)胞密度不同不同細(xì)胞表面生物學(xué)特性不同不同細(xì)胞表面分化抗原不同,血液中紅細(xì)胞與白細(xì)胞比例約為600~1000：1，兩者的比重不同其沉降速度也不同，通常用兩種方法加以分離。（直立靜置RT30～60min，緊貼紅細(xì)胞層上的白膜層）,,一、白細(xì)胞的分離,,1、自然沉降法外周血， 抗凝，靜置約一小時(shí)血液分為三層，上層為血漿，底層為紅細(xì)胞，緊貼紅細(xì)胞層上面的灰白層為WBC，輕輕吸取此層即可得

3、到富含WBC懸液，低滲破壞RBC，洗滌即可。無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。2、聚合物加速沉淀法某些高分子聚合物（如明膠、右旋糖酐、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使紅細(xì)胞凝聚成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之更易與白細(xì)胞分離。本法的細(xì)胞獲得率比自然沉降法高。,二、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離,外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell)主要指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的

4、細(xì)胞群。密度為1.075~1.090 。,人的紅細(xì)胞密度為1.093 粒細(xì)胞密度為1.092 單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的密度為1.075-1.090,,常用的分離劑為：Ficoll和Percoll分離劑1、 Ficoll分層液 主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，是一種單次密度梯度離心分離法。其主要成分為聚蔗糖(商品名為Ficoll )其密度為1.020?？蓪⒀悍殖伤膶?，從上到下依次是：血漿、單個(gè)核細(xì)胞、粒細(xì)胞

5、和紅細(xì)胞。Ficoll 成份：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液 + 1份34%泛影葡胺（hypaque)生理鹽水溶液。,人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分離,聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque),2、Percoll分層液是一種連續(xù)密度梯度離心分離法，其主要成分為：硅膠顆粒，其原液密度為：1.135。經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyr

6、olidone,PVP)處理的硅膠顆粒大小不一的混懸液。高速離心后，形成連續(xù)密度梯度（由下而上的逐減的連續(xù)密度梯度，density gradient），可將密度不同的細(xì)胞分離純化?？蓪⒀悍殖伤膶?，從上到下依次是：死亡細(xì)胞和血小板、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和紅細(xì)胞。淋巴細(xì)胞純度98%, 單核細(xì)胞純度78%。流程長, 步驟繁, 成本高。,三、淋巴細(xì)胞的分離與純化,PBMC懸液富含淋巴細(xì)胞，但有混雜有單核細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。,貼壁粘附法

7、 磁鐵吸引法 Percoll 分離液法,（去單核細(xì)胞）,紅細(xì)胞的去除: 無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。 血小板的去除: 離心洗滌2~3次。,貼壁粘附法 利用二者具黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝膠（Sephhadex G-10)等特性。95%為淋巴細(xì)胞，活性大于95% 。但損失部分B淋巴細(xì)胞。2.磁鐵吸引法 PBMC吞噬直徑3um的羰基鐵顆粒，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上清即含較純的淋巴細(xì)胞。

8、3. Percoll 分離液法,,E花環(huán)沉降法 EA花環(huán)沉降法 尼龍毛柱分離法,四、T細(xì)胞和B細(xì)胞的分離,,,（一）E花環(huán)沉降法 成熟T細(xì)胞表面有SRBC受體（E受體），可和SRBC形成E花環(huán)，B細(xì)胞則無。（二）EA花環(huán)B細(xì)胞表面帶有IgG Fc段受體，AgAb復(fù)合物中IgG Fc段牢固結(jié)合；這類紅細(xì)胞抗體致敏的動(dòng)物紅細(xì)胞（EA)黏附在B細(xì)胞周圍形成花環(huán)。,,（三）尼龍毛柱分離法,利用B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有黏附在尼龍（

9、nylon wool) 表面的特性。先洗脫出的事T細(xì)胞，再用培養(yǎng)也便沖洗邊捻壓塑料管，流出來的液體中主要含B細(xì)胞。T細(xì)胞純度達(dá)90%，B細(xì)胞純度達(dá)80% 。,（一）親和板結(jié)合分離（二）免疫磁珠分離（三）流式分選,五、細(xì)胞亞群的分離,T細(xì)胞：TCR、CD3、CD4、CD8、CD25等B細(xì)胞：BCR 、 CD19、CD5等NK細(xì)胞: TCR/CD3－、BCR/CD19－、CD56+、CD16+Macrophage: DC:M

10、ast cells:……,免疫細(xì)胞表面標(biāo)志,正選（positive selection）法：純化所需的細(xì)胞負(fù)選（negtive selection）法：去除不要的細(xì)胞，留下所需細(xì)胞,將所需的細(xì)胞對應(yīng)的單克隆抗體包被于小管內(nèi)→加入淋巴細(xì)胞→形成Ag-Ab復(fù)合物→洗去不反應(yīng)的物質(zhì)。,（一）親和板結(jié)合分離,（二）免疫磁珠分離,磁性微珠(magnetic beads,①免疫磁珠分離法具有高純度（80?99％），高得率（90?95％）

11、、高細(xì)胞活性（99 ? 100%）的特點(diǎn)，僅次或相當(dāng)于流式細(xì)胞儀（FACS）的分選效率。 ②與FACS 相比，本方法操作簡單、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)；可用做FACS分選前的預(yù)分離，以減少FACS所用時(shí)間。 ③另外連續(xù)兩次過柱分選可進(jìn)一步提高分選細(xì)胞純度，通?？蛇_(dá)95－99％。,注意事項(xiàng),如果分離細(xì)胞用作培養(yǎng)，全過程在超凈臺(tái)中完成。分離柱一般只能一次應(yīng)用，再用時(shí)分離效率降低?？贵w包被磁珠和死細(xì)胞常有非特異性結(jié)合，因而分選前應(yīng)去除死細(xì)胞

12、；上分離柱前，充分振蕩混懸細(xì)胞，打散細(xì)胞團(tuán)塊。用分離柱分選，應(yīng)用真空抽濾水，減少水中氣泡，使分離柱不被氣泡阻滯,熒光激活細(xì)胞分離儀(FACS)主要由4部分組成:細(xì)胞流動(dòng)系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng);激發(fā)系統(tǒng);檢測與訊號處理系統(tǒng);細(xì)胞分選系統(tǒng)。,（三）流式分選,熒光激活細(xì)胞分離儀（fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS）,細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動(dòng)系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測區(qū)。當(dāng)細(xì)胞從流動(dòng)

13、室噴嘴處流出時(shí)，超聲振蕩攪動(dòng)液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴，每小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞（其中只有百分之幾的液滴中含細(xì)胞）。,細(xì)胞經(jīng)激光照射產(chǎn)生熒光和散射光，信號經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)處理，分辨細(xì)胞的類型。如識別的是所需的細(xì)胞時(shí)（如T細(xì)胞），使液滴瞬即感應(yīng)陽電荷、陰電荷或不帶電荷，使所需的細(xì)胞在電場偏轉(zhuǎn)下進(jìn)入不同的收集管。,,①用FACS分離細(xì)胞準(zhǔn)確快速、純度高、回收率高，能保持細(xì)胞活力，并可在無菌條件下進(jìn)行。 ②儀器昂貴，極少用于常規(guī)，而

14、多數(shù)僅作為研究的手段,1、分離細(xì)胞的保存  （1）短期保存  用含有10%~20%滅活小牛血清的 Hanks、RPMI 1640培養(yǎng)液可保存數(shù)周（2）長期保存及復(fù)蘇 保存：在保護(hù)劑二甲亞砜中于液氮（-196℃)中保存。其過程是：先對需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含有10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸 液，分裝于凍存管內(nèi)，立即放入降溫過渡站( -80℃)中，繼而進(jìn)行降溫

15、(-196℃)冷凍。,六、細(xì)胞的保存及活力測定,復(fù)蘇：將其從液氮中取出，立即放入40 ℃溫水中，融化后加入10倍的培養(yǎng)液混勻，低速離心，洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力。 2、細(xì)胞活力的檢測  常用方法是臺(tái)盼藍(lán)染色法。這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高，可使染料進(jìn)入細(xì)胞而使細(xì)胞著色（藍(lán)色）。,實(shí)驗(yàn)步驟,豚鼠的抓取保定豚鼠性情溫順，膽小易驚，一般不易傷人

16、。捉拿時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員可先用手輕輕扣、按住豚鼠背部，順勢抓緊其肩胛上方皮膚，拇指和食指環(huán)其頸部，用另一只手輕輕托住其臀部，即可將豚鼠抓取保定。兔的抓取保定家兔馴服不咬人，但四肢的爪尖銳，掙扎時(shí)容易抓傷人。抓取保定方法是用右手把兩耳拿在手心并抓住頸后部皮膚，提起家兔，然后用左手托住臀部。另一種方法是使用家兔保定欄。,一、動(dòng)物保定,（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其鈉鹽或鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，進(jìn)而抑制纖維蛋白原形成

17、纖維蛋白，從而阻止血液凝固。常用的肝素溶液濃度為1 000U/ml，市售肝素多為100U~126U／mg。使每ml血液含15U~20U肝素。（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一種螯合劑。用生理鹽水配制成4％的溶液備用。每ml血液加入1mg~2mg的EDTA。（3）阿氏液（Alsever液）： 枸櫞酸鈉（Na3C6H5O7·5H2O） 0.80g 枸櫞酸 0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化鈉 0

18、.42g H2O 加至 100.00ml 混勻溶解后，114.3℃高壓蒸汽滅菌10min備用。 阿氏液中既含有枸櫞酸鈉抗凝劑，又含有細(xì)胞生存的營養(yǎng)，所以它既可做抗凝劑，又可做血細(xì)胞的保存液。以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液，邊采邊輕輕搖動(dòng)采血瓶，使之混勻。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于紅細(xì)胞的保存。一般在4℃條件下，阿氏液中保存的紅細(xì)胞2周其活性和特性不變。,二、抗凝劑,采血前的準(zhǔn)備用注射器取3 ml淋巴細(xì)胞

19、分層液于一試管中.再用注射器吸?。瞞l的阿氏液，并保存在注射器中．心臟采血取血前應(yīng)探明心臟搏動(dòng)最強(qiáng)部位，通常在胸骨左緣的正中，選心跳最顯的部位作穿刺。針頭宜稍細(xì)長些，以免發(fā)生手術(shù)后穿刺孔出血。,三、豚鼠淋巴細(xì)胞的分離,取豚鼠抗凝血4毫升，加3毫升Hanks液使之稀釋。加于3毫升淋巴細(xì)胞分層液液面之上（沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混）。2000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘；用毛細(xì)吸管吸取界面處的淋巴細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞，置于含5倍體積的Han