生殖器皰疹和尖銳濕疣的檢測(cè)技術(shù)

1、一、生殖器皰疹,朱參勝 主任技師陜西省皮膚性病防治所陜西省性病中心實(shí)驗(yàn)室,2024/2/22,單純皰疹病毒（HSV）引起單純皰疹病毒（HSV)，大小：150-200nm；DNA病毒；20面核衣殼；胞膜；衣殼蛋白感染生殖器、肛門(mén)復(fù)發(fā)，無(wú)徹底治愈的方法具有嗜感覺(jué)神經(jīng)節(jié)，形成潛伏感染狀態(tài)檢測(cè)方法：細(xì)胞培養(yǎng)、核酸檢測(cè)、直接免疫熒光、型特異性血清型抗體檢測(cè)法,2024/2/22,,2024/2/22,胞膜糖蛋白：,HSV有10-

2、11種特異性糖蛋白抗原是細(xì)胞和體液免疫的主要靶標(biāo)也是預(yù)防和治療HSV感染的亞單位疫苗或DNA疫苗的候選基因gB,gC,gD,gE,gF,gG,gH,gI,gJ,gL,gM其中g(shù)G是型特異性糖蛋白，具有型特異性抗原決定簇，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體HSV抗原型：HSV1和HSV2,2024/2/22,2024/2/22,2024/2/22,HSV-2引起的生殖器和口腔皰疹,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,2024/2/22,

3、2024/2/22,HSV-1和HSV-2同源性高達(dá)50％感染方式與臨床表現(xiàn)不同? HSV-1：主要上半身皮膚和粘膜（口唇、咽、眼等）皰疹，嚴(yán)重者皰疹性腦炎 ，STI達(dá)10-40%；? HSV-2：主要生殖器感染（80％），偶可發(fā)生口腔及其周?chē)腥尽? HSV-1復(fù)發(fā)少，HSV-2復(fù)發(fā)高,HSV感染的臨床表現(xiàn)一、皰疹：10-20% 1. 初發(fā)皰疹： 原發(fā) ：無(wú)病史且HSV1/2抗體陰性 非原發(fā) ：

4、一種抗體陽(yáng)性，而引起皰疹病毒型抗體陰性。 原發(fā)與非原發(fā)臨床不能區(qū)別，必須實(shí)驗(yàn)室鑒別。 第一次癥狀（復(fù)發(fā)）：血清學(xué)陽(yáng)性但以前未出現(xiàn)皰疹 2. 復(fù)發(fā)皰疹：有典型病史，HSV2較1復(fù)發(fā)率高，男比女高二、潛伏感染：80-90％HSV感染,2013.8,HSV傳播途經(jīng),來(lái)自無(wú)癥狀的排毒者（最常見(jiàn)）70％HSV2感染來(lái)自性伴無(wú)癥狀排毒期。通常有癥狀期性活動(dòng)較少。多數(shù)病例否認(rèn)與感染者接觸的病史。與傳染性潰瘍接觸（ 排毒

5、達(dá)高峰，傳染性最強(qiáng)）母嬰傳播：分3個(gè)階段子宮內(nèi)：經(jīng)胎盤(pán)或?qū)m頸上行感染，導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)、流產(chǎn)、畸形、死亡。圍產(chǎn)期：占85％，經(jīng)產(chǎn)道40-60％機(jī)會(huì)被感染出生后：接觸外部HSV傳染源，如母親口腔感染等。,2013.8,HSV感染后,潛伏活動(dòng)導(dǎo)致長(zhǎng)期持續(xù)感染新生兒皰疹發(fā)病率和死亡率嚴(yán)重HIV感染協(xié)同因素80-90％HSV感染為潛伏感染,2013.8,基本原理：HSV在細(xì)胞內(nèi)寄生—體外細(xì)胞培養(yǎng)—特征細(xì)胞改變觀察。標(biāo)本采集：皰液

6、：抽取或棉簽吸取后洗脫。潰瘍組織液：干拭子去除污物，棉簽吸取后洗脫。子宮頸分泌物：拭去黏液后，用另一棉拭子插入子宮頸，捻轉(zhuǎn)取樣。儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞（Hela細(xì)胞），RPMI1640，小牛血清等。,（一）細(xì)胞培養(yǎng)法,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,操作步驟：?jiǎn)螌蛹?xì)胞制備：24孔板培養(yǎng)，長(zhǎng)成單層細(xì)胞備用（常用細(xì)胞株為Vero, Hela, BHK)標(biāo)本接種：接種0.2ml，培養(yǎng)3~7日CPE (cytopa

7、thic effect)觀察：接種后，每日觀察病毒傳代：至少50%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，收集培養(yǎng)物，再次接種至新鮮細(xì)胞中。鑒定和分型：50%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，收集感染細(xì)胞和培養(yǎng)物，離心后，沉淀用免疫熒光或酶免試驗(yàn)鑒定。,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,結(jié)果判讀：觀察CPE:連續(xù)7日觀察，細(xì)胞一般在2~4日出現(xiàn)病變，變圓，腫脹和氣球樣變，可見(jiàn)融合細(xì)胞和多核巨細(xì)胞，初步判定HSV陽(yáng)性。用免疫熒光法對(duì)HSV進(jìn)一步鑒定和

8、分型。結(jié)果報(bào)告：出現(xiàn)CPE: “單純皰疹病毒分離可疑”鑒定后：“單純皰疹病毒I型（II型）生長(zhǎng)”臨床意義：細(xì)胞培養(yǎng)法是“金標(biāo)準(zhǔn)”用免疫熒光法對(duì)HSV進(jìn)一步鑒定和分型,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,注意事項(xiàng):選擇敏感細(xì)胞系，且細(xì)胞應(yīng)為活力強(qiáng)的幼齡細(xì)胞取材時(shí)不用消毒劑和潤(rùn)滑劑盡量取水泡液或膿皰液進(jìn)行接種培養(yǎng)取材后盡快接種，24h不能接種，存放于-70℃其他皰疹病毒如水痘，帶狀皰疹病毒感染也可以引起類(lèi)似的C

9、PE，因此需要進(jìn)一步鑒定,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,HeLa細(xì)胞株是由正常子宮頸細(xì)胞被一種人類(lèi)乳突狀瘤病毒（Human Papillomavirus 18 或HPV18）轉(zhuǎn)型成癌細(xì)胞的，而且和正常子宮頸細(xì)胞有許多不同。,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,Hela 細(xì)胞感染HSV-2:A 正常細(xì)胞；B:HSV-2感染細(xì)胞。,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,（二）直接免疫熒光抗原檢測(cè),基本原理：HS

10、V抗體(標(biāo)記FITC)→標(biāo)本HSV→熒光顯微鏡觀察標(biāo)本采集：細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本：收集細(xì)胞培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本，可作細(xì)胞爬片。病損標(biāo)本：收集病損部位基底部細(xì)胞儀器設(shè)備：熒光顯微鏡；HSV(I/II)mAb; PBS溶液操作步驟：固定：冷丙酮（-20℃）或甲醇固定標(biāo)本10min洗滌：PBS洗3次，或自然干燥染色：雙份標(biāo)本中滴加HSV-1和HSV-2熒光抗體工作液，37℃濕盒30min洗滌：PBS,雙蒸水封片鏡檢：90%甘油+10%PB

11、S,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,結(jié)果判讀：陽(yáng)性、陰性對(duì)照結(jié)果正常陽(yáng)性標(biāo)本為亮綠色熒光結(jié)果報(bào)告：陽(yáng)性：見(jiàn)到上述熒光陰性：未見(jiàn)到上述熒光臨床意義：一般用于HSV分離培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的鑒定和分型注意事項(xiàng):每批試驗(yàn)均設(shè)置對(duì)照高質(zhì)量熒光顯微鏡和技術(shù)熟練操作人員取材是應(yīng)避免出血，以免影響結(jié)果判斷直接皮損標(biāo)本：容易脫片,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,（三）抗

12、原ELISA法,基本原理：抗HSV單克隆抗體包被→標(biāo)本HSV抗原→酶標(biāo)記抗體，底物顯色。標(biāo)本采集：同細(xì)胞培養(yǎng)法操作步驟：加樣：對(duì)照和樣品，孵育加酶結(jié)合物：洗板后，加入酶結(jié)合物，孵育顯色：終止：,2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,結(jié)果判讀：陽(yáng)性、陰性對(duì)照在規(guī)定范圍根據(jù)要求計(jì)算設(shè)定閾值結(jié)果報(bào)告：陽(yáng)性陰性臨床意義：臨床上常用的檢測(cè)抗原的方法注意事項(xiàng):采用部位正確，盡可能多采樣不同批號(hào)試劑禁止混用,

13、2013.8,陜西省皮膚性病防治所 朱參勝,（四）抗體檢測(cè),ELISA:檢測(cè)原理：將型特異性HSV抗原gG包被在酶標(biāo)板微孔中俘獲血清中的HSV抗體，形成抗原抗體復(fù)合物再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人抗體結(jié)合，加入酶底物顯色酶標(biāo)儀比色定量血清中HSV抗體含量。器材：酶標(biāo)儀，洗板機(jī)、恒溫水浴箱、型特異HSV-ELISA試劑盒。檢測(cè)流程：試劑準(zhǔn)備（平衡，混勻，稀釋?zhuān)幮裕?yáng)性對(duì)照設(shè)置；加入標(biāo)本；溫育；洗版；加酶標(biāo)記物；洗板；顯色；

14、終止；讀板。結(jié)果判讀及報(bào)告：陽(yáng)性、陰性對(duì)照應(yīng)在要求范圍；臨界值確定。陽(yáng)性、陰性判定。CIA:(省略）,2024/2/22,HSV型特異性抗體檢測(cè)的臨床意義,HSV感染診斷：首次感染93％IgM陽(yáng)性，復(fù)發(fā)感染13％以下，IgG↑HSV分型診斷：HSV1和HSV2感染的嚴(yán)重程度和預(yù)后存在差異，為預(yù)后提供參考依據(jù)。原發(fā)與復(fù)發(fā)皰疹類(lèi)型的鑒別檢出隱性感染：80-90%無(wú)癥狀感染，減少性與母嬰傳播,2024/2/22,感染者性伴的HSV感

15、染狀況的判斷：80%以上的患者渴望了解自身和伴侶的HSV感染的血清型，并且獲知結(jié)果后對(duì)治療方案的依從性增加79%。HSV感染的血清流行病學(xué)調(diào)查：為衛(wèi)生監(jiān)管部門(mén)提供更加有效、可靠的HSV的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。用于性病門(mén)診（診斷與高危人群篩查）生殖醫(yī)學(xué)門(mén)診 (提高IVF的成功率)婦產(chǎn)科門(mén)診(孕前和產(chǎn)前篩查，減少新生兒皰疹感染)器官移植科（檢測(cè)HSV感染）,2024/2/22,（五）核酸檢測(cè),目的基因：目前均選擇高保守序列區(qū)，主要集中在

16、DNA聚合酶基因區(qū)、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因區(qū)、糖蛋白基因區(qū)。原理：一對(duì)單純皰疹病毒型特異性引物一條單純皰疹病毒型特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、Taq酶、dNTPs,用PCR體外擴(kuò)增法檢測(cè)單純皰疹病毒DNA臨床意義：鑒別診斷潰瘍或生殖器皰疹的患者，區(qū)分I和II型HSV病毒；對(duì)腦組織、腦脊液測(cè)定有優(yōu)勢(shì)。,2024/2/22,（六）檢測(cè)方法評(píng)價(jià),急性期感染確診：培養(yǎng)法：金標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)條件，人員素質(zhì)要求高。免疫學(xué)方法：區(qū)

17、分型別。核酸檢測(cè)：敏感性最高，SFDA認(rèn)可的試劑；HSV感染篩查，無(wú)癥狀感染者檢查：血清抗體檢測(cè)（ELISA/CIA)：婦產(chǎn)科、性病門(mén)診廣泛使用，說(shuō)明以前感染過(guò)HSV，IgM近期感染。,2024/2/22,二、尖銳濕疣,尖銳濕疣：(Condyloma Acuminatum ,CA)，又稱(chēng)生殖器疣，是由人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)引起，主要通過(guò)性傳播、在肛門(mén)及外生殖器所致的表皮瘤樣增生的一種

18、STD。HPV：人類(lèi)乳突病毒（Human Papillomavirus，）是一種分子較小（直徑55nm）的DNA病毒。已知的人類(lèi)乳突病毒有一百多種基因型，其中有三十余種會(huì)感染人類(lèi)生殖器官的皮膚及黏膜，造成各種疾病。主要類(lèi)型為HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，其中HPV16和18型長(zhǎng)期感染可能與女性宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。,2024/2/22,病毒DNA：8000個(gè)堿基對(duì)非編碼上游調(diào)節(jié)（ LCR ）,早期 ORF

19、(E1- - E7) ；晚期 ORF(L1 和 L2)分型：按E6,E7,L1的ORF，DNA序列同源性小于90%HPV的致病性:引起細(xì)胞良性增生：扁平疣、尋常疣、尖銳濕疣誘導(dǎo)細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)化:宮頸癌、 肛門(mén)癌檢測(cè)方法：HPV核酸檢測(cè)和組織病理檢測(cè)。,2024/2/22,,根據(jù)HPV引起細(xì)胞病理變化的不同，分為高危型和低危型? 高危型 ：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68? 低危

20、型：6、11、42、43、44,2024/2/22,HPV傳播途徑,? 性接觸傳播：HPV的主要感染方式，相同的HPV亞型可以在性伴侶中檢出。? 直接接觸：皮膚直接接觸也是傳播方式? 母嬰傳播：母親生殖道HPV感染也可以傳給嬰兒,2024/2/22,癥狀和體征,HPV感染后，潛伏期3周～8個(gè)月，平均3個(gè)月。男性：多見(jiàn)于冠狀溝、包皮、系帶、龜頭和肛周，其次是尿道口、陰莖體和陰囊；女性：多見(jiàn)于大小陰唇、后聯(lián)合、陰蒂、宮頸、陰道壁和肛

21、周。其它：腋下、腹股溝、乳房下和口腔內(nèi),2024/2/22,特征,初發(fā)為淡紅、褐色細(xì)小丘疹，針頭至綠豆大小。以后突起，逐漸增大增多并擴(kuò)散蔓延，表面粗糙。疣體：丘疹型、乳頭型、菜花型、雞冠型和巨大型CA。一般無(wú)感覺(jué)，部分有異物、癢或壓迫感，或因磨擦而破潰、糜爛，性交易出血。女性患者常伴陰道炎。鑒別診斷：假性濕疣 （陰莖珍珠狀丘疹，絨毛狀小陰唇），扁平濕疣、鮑溫樣丘疹病和鱗狀細(xì)胞癌。,2024/2/22,2024/2/22,部位：外

22、生殖器或肛門(mén)皮損特點(diǎn)：疣狀、菜花狀贅生物,2024/2/22,2024/2/22,醋酸白試驗(yàn)：用5%醋酸溶液涂抹皮損處，3～5 min后皮損表面變白，輔助性診斷。,實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),基本原理：兩類(lèi)引物：通用引物針對(duì)L1的保守區(qū)，可以擴(kuò)增所有性病相關(guān)HPV-DNA；另一類(lèi)特異的引物和探針。探針：標(biāo)記不同熒光的型特異性探針；5’端R基團(tuán)和3’端Q基團(tuán)；反應(yīng)前探針完整，無(wú)熒光；反應(yīng)后，R基團(tuán)和Q基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光；每完成一次擴(kuò)增，

23、就形成一個(gè)熒光分子自動(dòng)熒光檢測(cè)儀測(cè)定儀器設(shè)備：熒光PCR儀；恒溫水??；高速離心機(jī)；試劑盒；標(biāo)本采集：宮頸分泌物陰道分泌物男性尿道分泌物組織表面標(biāo)本,2024/2/22,標(biāo)本的采集,? 標(biāo)本取材部位：宮頸，外陰，包皮龜頭等? 標(biāo)本類(lèi)型：贅生物、丘疹、無(wú)癥狀等? 采集方法：? 贅生物用鈍刀或拭子刮取組織細(xì)胞? 宮頸拭子? 直腸拭子的取材,2024/2/22,操作步驟：分泌物和刮取物標(biāo)本的處理：充分振蕩，洗脫至1ml

24、生理鹽水中，12 000rpm離心5分鐘，棄上清；新鮮組織需勻漿；石蠟包埋組織：切片，脫蠟、乙醇洗滌干燥，提取。DNA提取：加入DNA提取液，煮沸10min，離心上清液為模版；加樣：PCR反應(yīng)管加入陽(yáng)性、陰性對(duì)照，樣品PCR擴(kuò)增：將反應(yīng)管放入PCR儀，設(shè)置名稱(chēng)，反應(yīng)條件，熒光種類(lèi)，并開(kāi)始運(yùn)行儀器。,2024/2/22,結(jié)果判讀及報(bào)告：實(shí)驗(yàn)有效性判斷，陰性不是S型曲線，陽(yáng)性為S型曲線，CT=給定值或參考范圍。根據(jù)CT值，確定陰性，陽(yáng)

25、性，可疑。臨床意義：很高的敏感性和特異性，HPV檢測(cè)較為可靠的方法大量人群感染HPV不發(fā)病，用于尖銳濕疣時(shí)，結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)史綜合分析不典型癥狀確診尖銳濕疣療效判定注意事項(xiàng)：分區(qū)進(jìn)行檢測(cè)β-球蛋白基因評(píng)價(jià)標(biāo)本是否合格陰性不排除其他型別HPV感染（100種）,2024/2/22,核酸雜交技術(shù),HPV基因直接雜交：原位雜交、斑點(diǎn)雜交、southern轉(zhuǎn)移雜交；擴(kuò)增后雜交：反向膜雜交、雜交捕獲法原位雜交：細(xì)胞內(nèi)HP

26、V病毒的檢測(cè)和定位。southern轉(zhuǎn)移雜交：電泳分離后雜交。雜交捕獲法：唯一通過(guò)FDA批準(zhǔn)，RNA探針，雜交，化學(xué)發(fā)光放大信號(hào)，檢測(cè)低危和高危HPV，不能分型。反向斑點(diǎn)雜交：國(guó)內(nèi)SFDA注冊(cè)批準(zhǔn)，生物素/地高辛標(biāo)記的通用引物擴(kuò)增目的基因，雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變形后與固定于硝酸纖維素上特異性探針進(jìn)行雜交，加入酶標(biāo)地高辛抗體，加入底物，顯色反應(yīng)，形成斑點(diǎn)，區(qū)分HPV型別。,2024/2/22,病理學(xué)檢查法,基本原理：HPV感染—疣

27、狀皮損—細(xì)胞結(jié)構(gòu)和排列發(fā)生改變：乳頭瘤樣增生、表皮角化不全、棘層肥厚、真皮淺層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、表皮內(nèi)空泡化細(xì)胞等。標(biāo)本采集:手術(shù)或剪除法切去病變組織，立即放入盛有10%中性福爾馬林小瓶中固定。,2024/2/22,操作步驟：脫水： 將固定的組織塊置入70%、80%、95%和無(wú)水乙醇中透明：置入二甲苯中浸蠟：熱石蠟注入蠟?zāi)Ｖ?，稍凝固后，放入組織塊切片裱片：將切片貼在潔凈載玻片上烤片：切片置入72℃烤箱中1~2h脫蠟：置入二

28、甲苯中脫蠟10~15min脫水： 100%、95%、80%脫水1~2min染色：蘇木素染色洗片：自來(lái)水沖洗15min分化：置入鹽酸中分化1-2min染胞質(zhì)：伊紅染色脫水： 95%和無(wú)水乙醇中，各3~5min透明：二甲苯中二次封片：中性樹(shù)膠,2024/2/22,結(jié)果判讀細(xì)胞核深藍(lán)色，胞質(zhì)紅色，可見(jiàn)乳頭瘤增生，角化不全、角化過(guò)度、表皮荊棘層肥厚、基底細(xì)胞增生、真皮淺層血管擴(kuò)張，并有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。表皮淺層可見(jiàn)呈灶狀、片狀及

29、散在分布空泡化細(xì)胞：該細(xì)胞體積大，核深染，核周?chē)梢?jiàn)不同程度的空泡化改變，輕者核周?chē)鷥H有空泡化的暈環(huán)，重者整個(gè)胞質(zhì)均發(fā)生空泡化改變，胞質(zhì)內(nèi)可有絲網(wǎng)狀或絮狀改變結(jié)果報(bào)告：根據(jù)以上病理組織像進(jìn)行報(bào)告,2024/2/22,臨床意義：特征性病理組織像可作為明確診斷尖銳濕疣的重要依據(jù)如在病理組織切片中未見(jiàn)空泡化細(xì)胞，僅見(jiàn)片狀角化不全或表皮乳頭瘤樣增生時(shí)，并不能排除尖銳濕疣注意事項(xiàng)：必要時(shí)，應(yīng)多取材和連續(xù)切片，直到查見(jiàn)特征性病理改變，結(jié)

30、合臨床進(jìn)一步診斷典型病理改變高度提示HPV感染,2024/2/22,2024/2/22,檢測(cè)方法評(píng)價(jià),HPV實(shí)時(shí)定量PCR:無(wú)需擴(kuò)增后續(xù)處理，但不能確定HPV的具體型別或確定的型別較少（6，11，16，18）；用于無(wú)癥狀篩查，有癥狀病原學(xué)診斷。HC-II法：診斷出高危和低危感染，不能確定具體型別；用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。PCR反向雜交技術(shù)：敏感，檢測(cè)各種型別；用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。組織病理學(xué)：損傷大，診斷尖銳濕疣特異性高。,2024/2/22,小

31、結(jié),CA由HPV感染引起，但HPV感染不僅僅引起CACA的診斷主要依賴與臨床，實(shí)驗(yàn)室為輔助性HPV檢測(cè)與分型：CA診斷、高危鑒定、復(fù)發(fā)判斷。,2024/2/22,性病規(guī)范實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收（討論）,發(fā)文（條件\要求）申報(bào)條件：梅毒（ELISA/CIA（可選）、TPPA、RPR/TRUST，PCR（可選)淋?。ㄅ囵B(yǎng)法、PCR可選）CT（PCR法）HSV-1，2：ELISA/CIA，PCR尖銳濕疣：HPV-6，11/通用/分型驗(yàn)收