ighccnd1融合基因--輔助診斷套細(xì)胞淋巴瘤。

1、分子技術(shù)在腫瘤靶向藥物治療的應(yīng)用,中南大學(xué)病理學(xué)系 湘雅醫(yī)院病理科,周建華,腫瘤靶向治療（Target therapy of cancer）,依據(jù)已知腫瘤發(fā)生的異常分子和基因，設(shè)計(jì)和研發(fā)針對(duì)這些特定的分子和靶點(diǎn)藥物，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的治療方法；靶向治療的前提就是明確腫瘤的特異靶基因變異類(lèi)存在與否和變異類(lèi)型；個(gè)體化治療的雛形。,熒光原位雜交（ Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH ）技術(shù)

2、,簡(jiǎn)介,FISH = Fluorescence In Situ Hybridization利用熒光標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)與其互補(bǔ)的DNA片段應(yīng)用：遺傳病診斷 血液腫瘤 實(shí)體瘤樣本：羊水、絨毛、流產(chǎn)組織、外周血、骨髓、體液及各種腫瘤組織等,FISH檢測(cè)染色體易位（Translocation）在淋巴瘤分型中的應(yīng)用,FISH技術(shù)在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用,檢測(cè)技術(shù)特點(diǎn),不同類(lèi)型的淋巴瘤染色體易位類(lèi)型不同優(yōu)點(diǎn)適用于形態(tài)學(xué)

3、上難以診斷且IHC結(jié)果不理想的標(biāo)本；適用于細(xì)胞數(shù)量少，形態(tài)不典型的活檢及穿刺組織。必須結(jié)合組織形態(tài)學(xué)和免疫組化結(jié)果作最后診斷?。。?FISH基因檢測(cè)在淋巴瘤的應(yīng)用,彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL） 按免疫組化亞型分為 CD5陽(yáng)性DLBCL 生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型(GCB)、 非生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型(non-GCB) 3類(lèi),可根據(jù)C

4、D10、BCL6、MUM1的表達(dá)區(qū)分生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型、非生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型。>30%瘤細(xì)胞表達(dá)CD10或CD10(-)、BCL-6(+)、MUM-1(-)診斷為GCB;其他病例則為non-GCB。,◆ BCL6基因斷裂---輔助診斷彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤,◆ BCL6基因斷裂重排----判斷預(yù)后,目前研究確定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。,一項(xiàng)針對(duì)102名DLBCL患者的BCL6重排情況及其與預(yù)后關(guān)系的研究顯

5、示，BCL6陽(yáng)性患者診斷治療36個(gè)月后，疾病停止發(fā)展的比率為82%，攜帶有BCL6重排的病例預(yù)后較好。,BCL6 基因斷裂與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤,Offit, K. N Engl J Med, 1994. 331(2): p. 74-80.,結(jié)果判讀,IGH/CCND1融合基因可見(jiàn)于95%的套細(xì)胞淋巴瘤，是套細(xì)胞淋巴瘤與其他淋巴瘤鑒別的重要指標(biāo)。,IGH/CCND1融合基因--輔助診斷套細(xì)胞淋巴瘤。,IGH/CCND1融合基因與套細(xì)胞淋

6、巴瘤,,l 正常細(xì)胞：兩個(gè)紅色信號(hào)，兩個(gè)綠色信號(hào)。l 異常細(xì)胞：一個(gè)紅色信號(hào)，一個(gè)綠色信號(hào)，兩個(gè)融合信號(hào)。,API2/MALT1基因檢測(cè)試劑盒,探針：GLP API2/GLP MALT1,凋亡抑制因子2基因（apoptosis inhibitor-2,API2）,位于11號(hào)染色體;粘膜相關(guān)淋巴組織基因（Mucosa-associated lymphoid tissue 1 ,MALT1 ），位于18號(hào)染色體。,API2基因與

7、MALT1基因的融合導(dǎo)致凋亡抑制的增加，引起細(xì)胞不依賴于抗原刺激的生存優(yōu)勢(shì)。,API2/MALT1融合基因的檢測(cè)可以指導(dǎo)抗HP治療,胃MALT淋巴瘤與幽門(mén)螺旋桿菌（HP）感染導(dǎo)致的慢性胃炎有關(guān)，MALT1/API2融合基因陰性的患者抗HP治療有效，陽(yáng)性患者抗HP治療無(wú)效。,API2/MALT1融合基因檢測(cè)意義,l 正常細(xì)胞：兩個(gè)紅色信號(hào)，兩個(gè)綠色信號(hào)。l 異常細(xì)胞：一個(gè)紅色信號(hào)，一個(gè)綠色信號(hào)，兩個(gè)融合信號(hào)。,BCL2/IGH重

8、排發(fā)生在約80%-85%的FL患者中，檢測(cè)BCL2/IGH基因重排可以輔助診斷FL。,BCL2/IGH陰性的FL患者3年生存率為100%，而陽(yáng)性者只有54%； 陰性者3年疾病無(wú)進(jìn)展為87.5%，而陽(yáng)性者只有13%。,BCL2/IGH融合基因與濾泡性淋巴瘤,BCL2/IGH融合基因-----輔助診斷濾泡性淋巴瘤,BCL2/IGH融合基因-----判斷預(yù)后,,l 正常細(xì)胞：兩個(gè)紅色信號(hào)，兩個(gè)綠色信號(hào)。l 異常細(xì)胞：一個(gè)紅色信號(hào)，一

9、個(gè)綠色信號(hào)，兩個(gè)融合信號(hào)。,結(jié)果判讀-陽(yáng)性結(jié)果,結(jié)果判讀-陽(yáng)性結(jié)果,約80%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(8；14) （q24;q32）； 約15%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(2；8)(p11;q24)； 約5%發(fā)生t(8；22)（q24;q11）。 染色體易位導(dǎo)致C-MYC基因斷裂重組可能是伯基特淋巴瘤的一個(gè)標(biāo)志，可以應(yīng)用于臨床上伯基特淋巴瘤的輔助診斷。,C-MYC基因斷裂與伯基特淋巴瘤,輔助診斷伯基特淋巴瘤,結(jié)

10、果判讀-陽(yáng)性結(jié)果,FISH技術(shù)在乳腺癌靶向治療應(yīng)用,乳腺癌 Her-2基因,致癌基因：Her-2基因； 位點(diǎn)：17q11.2-q12； 編碼蛋白：跨膜蛋白（與 表皮生長(zhǎng)因子受體部分同源）； 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴(kuò)增； HER-2基因擴(kuò)增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標(biāo)。HER2擴(kuò)增的乳腺癌更具有侵襲性生長(zhǎng)能力。,乳腺癌Her-2基因及蛋白檢測(cè),Cerb-B-2 :3+ 完全強(qiáng)

11、膜陽(yáng)性細(xì)胞>30% 2+,1 +,- FISH檢測(cè)是否有基因擴(kuò)增,基因突變檢測(cè)方法,1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage) 2.變性梯度凝膠電泳(DGGE)3. 雜合雙鏈分析法(HA)4. 化學(xué)切割錯(cuò)配(CCM) 5.碳化二亞胺檢測(cè)(Carbodiimide,CDI) 6.酶促切割錯(cuò)配(Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7.單鏈構(gòu)

12、象多態(tài)性 (Single-Strand Conformation)8.切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性 9.DNA測(cè)序(Sequencing) 10.雙脫氧指紋圖譜法(Dideoxy Finger-printing, ddF)11.錯(cuò)配接合蛋白檢測(cè) 12.蛋白截短測(cè)試（protein truncation test）,方法,13.變性的高效液相色譜檢測(cè)(Denaturing High Performance Liguld Chromatog

13、raphy DHPLC) 14.DNA芯片技術(shù)(DNAchip) 15.等位基因特異性擴(kuò)增16.等位基因特異性寡核苷酸片段分析(Allele-Specific Oligonucleotide,ASO)17.引物延伸檢測(cè)(Primer Extension,PEX)18.寡核苷酸連接檢測(cè)(Oligonucleotide Ligation Assay,OLA)19.限制性片段分析(Restriction Fragment Anal

14、ysis）20.突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR）21.蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpions amplification refractory mutation system）,肺癌組織EGFR基因擴(kuò)增和突變檢測(cè)及其臨床意義,研究背景,研究顯示吉非替尼對(duì)部分晚期NSCLC患者的治療效果非常顯著。存在EGFR基因突變的患者更有可能對(duì)吉非替尼的治療敏感。 存在EGFR基因擴(kuò)增的肺癌、腸癌病人對(duì)分子

15、靶點(diǎn)藥物更為敏感。檢測(cè)大腸癌有無(wú)EGFR過(guò)度表達(dá)，只要>1%的癌細(xì)胞的胞膜強(qiáng)陽(yáng)性染色即判斷為3+，可作為應(yīng)用西妥昔單抗的指征。,,,,FISH檢測(cè)EGFR基因擴(kuò)增標(biāo)本類(lèi)型：石蠟包埋組織（手術(shù)、活檢、穿刺） 冰凍組織 胸、腹水沉渣細(xì)胞 探針類(lèi)型：GLP EGFR / CSP7 定量PCR檢測(cè)EGFR基因突變分型 突變類(lèi)型： 19 exon （2235

16、-2249位點(diǎn)）15bp缺失突變 19 exon （2240-2257位點(diǎn)）18bp缺失突變 19 exon （2240-2251位點(diǎn)）12bp缺失突變 21 exon 2573位點(diǎn)T>G堿基置換突變 21 exon

17、2582位點(diǎn)T>G堿基置換突變,EGFR基因變異檢測(cè),,,,,,FQ-PCR分型技術(shù)檢測(cè)EGFR突變,存在EGFR突變肺癌樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖,71例肺癌組織中檢測(cè)出6例突變樣本,FQ-PCR 檢測(cè)15bp缺失陽(yáng)性病例結(jié)果,,紅色閾值線以上的擴(kuò)增曲線即為陽(yáng)性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，按熒光信號(hào)值的高低依次為 9號(hào)、12號(hào)、13號(hào)、55號(hào)、38號(hào)和33號(hào)標(biāo)本,15bp缺失突變型DNA的測(cè)序圖,sense,antisense,目前K-RAS突

18、變檢測(cè)常用技術(shù),方法,直接測(cè)序焦磷酸測(cè)序高分辨率熔解曲線PCR-RFLP芯片雜交Real-Time PCR,腫瘤組織的確認(rèn)和篩選,顯微切割腫瘤提取DNA,相應(yīng)的PCR反應(yīng)或雜交,相關(guān)的分析和檢測(cè),,,,K-ras突變檢測(cè)基本流程圖,直接測(cè)序(Direct Sequencing),PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物直接測(cè)序雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger法) DNA 片段是熒光標(biāo)記的，這些片段經(jīng)過(guò)平板膠電泳或毛細(xì)管電泳得到分離，熒

19、光分子被激發(fā)而發(fā)光，發(fā)出的光信號(hào)被檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè),,,,K-ras突變檢測(cè)結(jié)果,,療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物與預(yù)后判斷標(biāo)志物,療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物：能夠預(yù)測(cè)某種特定治療方式療效的標(biāo)記物KRAS基因突變導(dǎo)致腫瘤對(duì)EGFR抑制劑抵抗預(yù)后判斷標(biāo)志物：在不考慮治療因素的情況下能夠判斷患者結(jié)局的標(biāo)記物18號(hào)染色體長(zhǎng)臂（18q）缺失 某些分子標(biāo)志物兼具兩種作用胸腺嘧啶合成酶（Thymidylate synthase）,EGFR 作為預(yù)后因子的價(jià)值,

20、EGFR expression correlates with poor prognosis,DFS = Disease-free survival; OS = overall survival,Cetuxamab(西妥昔單抗)人源化嵌合單抗（ IgG1 ）靶向作用于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）阻斷EGF 和TGFα與EGFR 的結(jié)合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的腫瘤生長(zhǎng)200４年獲得FDA審批資格治療結(jié)直腸癌Panitumu

21、mab（帕尼單抗）完全人源化單克隆抗體(IgG2)靶向作用于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）2005年7月獲得FDA快速通道審批資格治療結(jié)直腸癌,結(jié)直腸癌分子靶向治療藥物,KRAS 突變,KRAS 突變可不依賴EGFR受體途徑，自行激活RAS/MAPK 通路導(dǎo)致ERBITUX 耐藥KRAS 突變與Erbitux療效及患者生存相關(guān)KRAS 突變并非孤立事件KRAS 突變常伴隨BRAF突變，并與 CpG 島甲基化表型(CIMP)1

22、,2相關(guān)KRAS 突變常伴隨 PI3K 突變3,Lièvre A, et al. J Clin Oncol 2008;26:374–379,MAPK = mitogen-activated protein kinase,K-ras基因野生型患者能從這類(lèi)藥物治療中獲益。 K-ras基因突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益,反而徒增不良反應(yīng)危險(xiǎn)和治療費(fèi)用；,抗EGFR治療和K-ras突變相互排斥,K-ras基因抗EGFR治療

23、關(guān)系密切,2009年7月FDA批準(zhǔn)了對(duì)西妥昔單抗和帕尼單抗說(shuō)明書(shū)標(biāo)簽的修改：,結(jié)直腸癌分子靶向治療藥物,注明KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者不推薦這使用這兩種用藥物。,K-ras基因突變: 20-60%結(jié)直腸癌 K-ras基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早期，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因高度保持一致,K-ras基因突變,NCCN臨床實(shí)踐指南指南明確指出所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者 都應(yīng)檢測(cè)K-ras基因狀態(tài)。 美國(guó)美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(

24、ASCO)推薦把K-ras基因突變檢測(cè)作為 結(jié)直腸癌患者接受EGFR單抗治療的預(yù)測(cè)指標(biāo)。 歐盟藥品審評(píng)管理局規(guī)定：cetuximab 及panitumumab 用于mCRC的治療前，患者必須確定為K-ras野生型。,K-ras與結(jié)直腸癌治療,結(jié)直腸癌（CRC）缺乏EGFR基因突變,對(duì)愛(ài)必妥單藥治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）臨床試驗(yàn)中110例活檢標(biāo)本進(jìn)行的研究未發(fā)現(xiàn) EGFR基因突變（外顯子18－21）,Khambata

25、-Ford S, et al. J Clin Oncol 2007;25:3230–3237,,,抗EGFR治療前檢測(cè)KRAS基因突變的理由,避免不必要的不良反應(yīng)控制不必要的費(fèi)用確認(rèn)能夠從治療中獲益的野生型患者避免治療對(duì)突變型患者的潛在毒性,CHMP gave a positive opinion for ERBITUX May 29, 2008 — but for patients with wild-type KRAS t

26、umors,,,810名胃癌病人有HER2基因的擴(kuò)增，約占參與實(shí)驗(yàn)總?cè)藬?shù)的22%；晚期胃癌接受標(biāo)準(zhǔn)化療聯(lián)合Herceptin治療的患者：平均生存期由11.1個(gè)月延長(zhǎng)到13.8個(gè)月； 高倍擴(kuò)增者甚至可達(dá)16個(gè)月； 將死亡風(fēng)險(xiǎn)降低26%。,HER2與胃癌分子靶向治療,美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)ASCO提出：,Herceptin可成為HER2陽(yáng)性晚期胃癌患者的 治療選擇。 晚期胃癌患者在確診時(shí)都應(yīng)接受HER2檢測(cè)；,HER基因與胃癌預(yù)