《生化大實(shí)驗(yàn)》

1、《生化大實(shí)驗(yàn)》,實(shí)驗(yàn)課程簡(jiǎn)介,生化大實(shí)驗(yàn)是一門綜合性的實(shí)驗(yàn)課程，教學(xué)的目的在于通過對(duì)生命物質(zhì)的分離制備，純化，分析等綜合性實(shí)驗(yàn)，在已掌握的基礎(chǔ)生物化學(xué)理論知識(shí)和生化實(shí)驗(yàn)常用方法的基本原理、基本操作技術(shù)（如滴定、比色、層析、電泳等）的基礎(chǔ)上，訓(xùn)練學(xué)生的綜合實(shí)踐動(dòng)手能力，掌握蛋白質(zhì)、酶、核酸等重要物質(zhì)的分離、純化等的測(cè)定技術(shù)。,目 錄,實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)二 離子交換法血清純化IgG實(shí)驗(yàn)三 離子交換層析法分離

2、血清白蛋白實(shí)驗(yàn)四 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分子量實(shí)驗(yàn)五 等電聚焦法測(cè)定樣品的等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒的分離與純化實(shí)驗(yàn)七 PCR擴(kuò)增目的基因片段實(shí)驗(yàn)八 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,（一）考馬斯亮藍(lán)法,,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量是利用蛋白質(zhì)--染料結(jié)合法的原理，定量測(cè)定微量蛋

3、白質(zhì)濃度快速、靈敏的方法。,考馬斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同樣色形式，紅色-棕黑色和藍(lán)色。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后有紅色-棕黑色和藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，測(cè)定595 nm吸光的增加量，可以測(cè)定與其結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)與染料結(jié)合速度很快，2min就可以反應(yīng)完全，并可以穩(wěn)定1h，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有很大的消光系數(shù)，使得測(cè)定蛋白質(zhì)濃度是靈敏度很高。測(cè)定范圍為10-100μg蛋白質(zhì)，微量測(cè)定時(shí)達(dá)到1-1

4、0μg蛋白質(zhì)。此反應(yīng)反復(fù)性好精度高，線性關(guān)系好。,【實(shí)驗(yàn)儀器及用品】,1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（0.1mg/ml）0.2g結(jié)晶牛血清白蛋白用0.9%NaCl 稀釋到2000ml。 2. 0.9%NaCl 3. 考馬斯亮藍(lán)試劑：100mg考馬斯亮藍(lán)G250溶于50ml 5%乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸餾水稀釋1000ml，濾紙過濾。 4. 待測(cè)蛋白：人血清，用前用0.9%NaC

5、l稀釋200倍。 5. 漩渦混合器,6. 移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2）， 5ml（×1）7. 分光光度計(jì)8. 試管1.5cm×15cm (×8)9. 量筒100ml(×1)10. 電子分析天平11. 試管架(×1),【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟】,一、標(biāo)準(zhǔn)曲線線的繪制 取7支干凈試管，按下表

6、進(jìn)行編號(hào)并加入試劑。 以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)年濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,2. 未知樣液的測(cè)定 另取一干凈試管，加入樣品1.0ml及考馬斯亮藍(lán)染液4.0ml，混勻，室溫靜置3min，于波長(zhǎng)595nm處比色，讀取吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找蛋白質(zhì)濃度。【注意事項(xiàng)】 1、如果測(cè)定的要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入5-20min內(nèi)測(cè)定吸光度，在這段時(shí)間內(nèi)樣色很穩(wěn)定。 2

7、、測(cè)定中，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物會(huì)吸附在比色皿上，實(shí)驗(yàn)證明可以忽視。測(cè)定完后可以用乙醇洗干凈。,【思考題】,1、根據(jù)一下要求選擇一種或者幾種蛋白質(zhì)定量測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 （1）樣品不容易溶解，但要求結(jié)果很準(zhǔn)確。 （2）要求在半天內(nèi)測(cè)定60個(gè)樣品。 （3）要求很迅速的測(cè)定一系列試管（30只）中溶液的蛋白質(zhì)濃度。 2、試著比較該法與其他幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。,二、紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)

8、含量,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1. 學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。 2. 掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和使用方法。【實(shí)驗(yàn)原理】 蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在280nm具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度成正比，因此可作蛋白質(zhì)定量分析。,利用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的優(yōu)點(diǎn)

9、是迅速，簡(jiǎn)便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定，因此廣泛應(yīng)用與蛋白質(zhì)和酶的生化制備。此法的缺點(diǎn)是：對(duì)酪氨酸和苯丙氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)測(cè)定有一定誤差。2若樣品種含有嘌呤嘧啶等會(huì)出現(xiàn)比較大的干擾，此時(shí)必須同時(shí)測(cè)定260和280nm吸光度，通過公式校正測(cè)定，以消除核酸的影響，而推算處蛋白質(zhì)濃度。 不同蛋白質(zhì)和核酸吸收是不同的，即使校正也存在誤差，但是可以做為初步測(cè)定。該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。,【儀器

10、與試劑】 1. 紫外分光光度計(jì)，比色管（10ml的5個(gè)），吸量管。 2. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0.9% NaCl溶液溶解0.25g結(jié)晶牛血清白蛋白，稀釋到250ml。 3. 待測(cè)蛋白溶液：用酪蛋白配制，濃度在1.0-2.5mg/ml 4. 0.9% NaCl溶液 5. 試管1.5cm×15cm（×9）

11、 6. 移液管1ml（×3），2ml（×2），5ml（×2）。,【實(shí)驗(yàn)步驟】 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取8只試管按表2-5加入試劑，搖勻。選擇光程1cm 石英比色皿，在280nm波長(zhǎng)測(cè)定A280，以A280值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,表1-2 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度---標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,（2）樣品測(cè)定： 

12、 配制待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1ml，加入蒸餾水3ml，搖勻，測(cè)定A280，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出蛋白質(zhì)濃度。 2. 直接測(cè)定法 在紫外分光光度計(jì)上，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液加入比色皿，以生理鹽水為對(duì)照，測(cè)定280nm和260nm波長(zhǎng)吸光度。按一下公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度： 蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260  (C為蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,A280和A260分別為蛋白質(zhì)

13、溶液在280nm和260nm處測(cè)得的吸光度值)。,本法適用于微量蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，對(duì)鹽類混雜的情況比較合適，為簡(jiǎn)便起見，對(duì)混合蛋白質(zhì)溶液，可用A280×0.75來表示蛋白質(zhì)大概濃度。【注意事項(xiàng)】 由于各種蛋白質(zhì)的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，顯色深淺隨不同蛋白質(zhì)改變，因而本法只適用于蛋白質(zhì)相對(duì)濃度的測(cè)定，核酸對(duì)結(jié)果也有影響，盡管進(jìn)行了公式校正，但是不同樣品干擾成分差異較大，致使280nm紫外吸收法檢測(cè)的準(zhǔn)確性較差。

14、【思考題】 1. 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理是什么？ 2. 影響紫外分光光度法測(cè)定準(zhǔn)確性的因素有那些？,三、Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?熟悉Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】 Folin-酚法又稱lowry法。首先在堿性溶液中形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，后與磷鉬酸-磷鎢酸作用，產(chǎn)生深藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物，這中復(fù)合物在750

15、nm和660nm處有最大吸收峰，顏色與蛋白質(zhì)濃度成正比，進(jìn)而可以計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。,【材料、試劑、與器具】,1. Folin-酚A（堿性銅試劑）：20g碳酸氫鈉和4g氫氧化鈉雙蒸水定容1000ml為儲(chǔ)備液1；0.5g五水硫酸銅1g Na3C6H5O7，定容100ml，為儲(chǔ)備液2。 將50ml儲(chǔ)備液1和1ml儲(chǔ)備液2混合為溶液A,混合后一日有效。 2. Folin-酚B：100g鎢酸鈉、2

16、5g鉬酸鈉、100g 蒸餾水、50ml80%磷酸、100ml濃硫酸在1500ml磨口圓底小瓶中混勻后接上磨口冷凝管，回流10h再加入硫酸鋰150g、蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴，開口煮沸15min，冷卻，稀釋至100ml過濾，至微綠，儲(chǔ)存于棕色瓶。臨用前氫氧化鈉滴定，用酚酞做指示劑，據(jù)滴定結(jié)果，將試劑稀釋至1mol/L的酸，冰箱保存。,3、標(biāo)準(zhǔn)濃度牛血清蛋白溶液200μg/ ml4、721分光光度計(jì)5、刻度吸管0.5ml（×

17、1），1ml（×2），5ml（×1）6、試管1.5cmX15cm8只7、恒溫水浴【操作步驟】1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,取6只試管，按下表加入試劑:,加入試劑A后，混勻，室溫10min，在加Folin-酚B 3.0ml，混勻后10min，再第二次加0.2ml，混勻放置30min。于660nm比色，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、樣品測(cè)定 取樣品1ml按上表加試劑，660nm處比色，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白

18、質(zhì)濃度。【思考題】 1、Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理是什么？ 2、影響Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的準(zhǔn)確性的因素有那些？,四、雙縮脲法,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。 【原理】 蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與C u2＋形成紫紅色絡(luò)合物，在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收。在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深

19、淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，可以用比色法定量測(cè)定 雙縮脲法通常用于需要快速但不十分精確的測(cè)定。,【試 劑 和 器 材】 1. 2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液 2. 容量瓶10ml（×6） 3. 試管1.5cm×15cm（×8） 4. 雙縮脲試劑：溶解0.175g硫酸銅（CuSO4 5H2O）溶于15ml水中，在100ml容

20、量瓶中加入30ml 濃氨水、30ml冷蒸餾水和20ml飽和氫氧化鈉，搖勻，室溫1-2h定容100ml，搖勻備用。在攪拌下加入300ml　10%氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1000ml，貯存在內(nèi)壁涂以石臘的瓶中。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。,5. 吸量管（1ml，2ml，5ml） 6. 721型分光光度計(jì)【操作步驟】 1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取6只試管編號(hào)，按下表

21、加入試劑，即得6種不同濃度的蛋白質(zhì)溶液。 另取試管7只，按0、1、2、3、4、5、6編號(hào)，1-6號(hào)分別加上述蛋白質(zhì)溶液3.0ml0號(hào)為對(duì)照，加3.0ml 蒸餾水分別加入，各試管中加雙縮脲試劑 2.0 ml混勻，紫色出現(xiàn)后，與540nm測(cè)定吸光度，閉塞測(cè)定法務(wù)必在30min內(nèi)完成，繪制蛋白質(zhì)濃度—吸光度曲線。,2. 未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 取樣品3.0ml于試管中，加雙縮脲試劑2.0ml混勻，于540n

22、m處測(cè)定其吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出蛋白質(zhì)濃度?！舅伎碱}】 1. 本法與其他測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法比較，有那些優(yōu)點(diǎn)？ 2. 若樣品中有干擾測(cè)定的雜質(zhì)，應(yīng)該如何校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果？,實(shí)驗(yàn)二 離子交換法血清純化IgG,【實(shí)驗(yàn)原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基 - 乙基 - 葡萄糖凝膠 A-50 ）為弱堿性陰離子交換劑。用 NaOH 將 Cl - 型轉(zhuǎn)變?yōu)?OH -

23、 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的 γ 球蛋白屬于中性蛋白（等電點(diǎn)為 pH6.85 ～ 7.5 ），其余均屬酸性蛋白。 pH 7.2 ～ 7.4 的環(huán)境中。酸性蛋白均被 DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有 γ 球蛋白便可在洗脫液中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的 IgG 。,【試劑與器材】,1. DEAE-Sephadex A-50 2. 0.5mol/L HCl 和 NaOH 3. 0.1

24、mol/L pH7.4 PBS 4. 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 5. 0.02 ％ NaN 3 6. PEG 7. 無水乙醇 8. 紫外分光光度計(jì) 9. 1cm×20cm 玻璃層析柱 10. 自動(dòng)部分收集器,【操作步驟】,1 ．DEAE-Sephadex A-50 預(yù)處理 稱 DEAE-Sephadex A-50 （下稱 A-50 ） 5g ，懸于 500ml 蒸餾水內(nèi)， 1

25、h 后傾去上層細(xì)粒。按每克 A-50 加 0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，將浸泡于 0.5mol/L NaOH 液中，攪勻，靜置 30min ，裝入布氏漏斗（墊有 2 層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至 pH 呈中性；再以 0.5mol/L HCl 同上操作過程處理，最后以 0.5mol/L NaOH 再處理一次，處理完后，將 A-50 浸泡于 0.1mol/L pH7.4 PBS 中過夜。,2 ．裝柱,（ 1 ）將層析

26、柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。 （ 2 ）將 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至 1/4 高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的 A-50 。待 A-50 凝膠沉降 2 ～ 3cm 高時(shí)，開啟出水口螺旋夾，控制流速 1ml/min ，同時(shí)連續(xù)倒入糊狀 A-50 凝膠至所需高度。 （ 3 ）關(guān)閉出水口

27、，待 A-50 凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。,3 ．平衡 啟開出水口螺旋夾，控制流速 4 滴 /min ，使約 2 倍床體積的洗脫液流出。并以 pH 計(jì)與電導(dǎo)儀分別測(cè)定洗脫液及流出液之 PH 值與離子強(qiáng)度，兩者達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口，停止平衡。 4 ．加樣及洗脫 啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相

28、切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品（ 0.5ml 血清，體積應(yīng)小于床體積的 2% ，蛋白濃度以＜ 100mg 為宜）。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁 2 ～ 3 次；再放開出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個(gè)洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速， 4 滴 /min.,5 ．收集 開始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集；每管收集 4ml. 共收

29、集 10 ～ 15 管。 6 ．測(cè)蛋白 以 751 型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管 A 260 ，按公式計(jì)算各管蛋白含量。并以 A 280 為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。 7 ．合并、濃縮 將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以 PEG （ Mw6000 ）濃縮至所需體積，加入 0.02 ％ NaN 3 防腐，于 4℃ 保存?zhèn)溆?。長(zhǎng)期保存時(shí)應(yīng)貯于 -40℃ 冰箱。 8 ． A-50 凝膠

30、的再生 在柱上先以 2mol/L NaCl 洗脫雜蛋白至流出液的 A 280 <0.02 ，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將 A-50 再處理一遍即達(dá)再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中 4℃ 保存；近期不用時(shí)，以無水酒精洗 2 次，再置 50℃ 溫箱烘干，裝瓶?jī)?nèi)保存。,實(shí)驗(yàn)三 離子交換層析法分離血清白蛋白,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通過對(duì)白蛋白純化的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生綜合運(yùn)用離子交換層析手段分離蛋白質(zhì)純品的技能。,

31、【基本原理】 離子交換是指液相中的離子與固定相上可解離基團(tuán)的可逆交換反應(yīng)。利用這個(gè)反應(yīng)先將要分離的混合物在一定pH 的溶液中解離，而后流經(jīng)固定相，使之與固定相上的可解離基團(tuán)進(jìn)行離子交換，吸附于固定相上，凡不能進(jìn)行交換吸附的成分，則流出層析柱外。,再根據(jù)交換吸附于固定相的各組分解離力度的差別，運(yùn)用不同的pH值或不同鹽濃度的溶液作流動(dòng)相，流過層析柱將各組分分別再交換洗脫下來，這樣混合物的各組分即被分開，達(dá)到分離的目的，

32、此即為離子交換層析。,【試劑與器材】,1. 20%磺酰水楊酸2. DEAE32－cellulose3. PBS（0.0175M pH6.7）：取0.2M Na2HPO4 3.5mL、0.2M NaH2PO4 56.5ml混合，用酸度計(jì)檢查pH值應(yīng)為6.7。取該混合液87.5ml用蒸餾水稀釋至1000mL。4. 0. 1N HCl和0.1N NaOH5. Nessler試劑6. 1cm×20cm層析柱7

33、. 黑、白比色板,【操作步驟】,1. DEAE32－纖維素的活化處理： (1)取DEAE32－纖維素1.5g（DEAE32－纖維素的量（干重），一般按樣品的蛋白質(zhì)量計(jì)算，大約是蛋白質(zhì)量的10~15倍）懸于0.1N NaOH溶液中，浸泡過夜，用300ml錐形瓶盛裝； (2)次日，在布氏漏斗上輕吸過濾，用蒸餾水洗，直至pH.8.0左右，抽干；(3)用0.1N HCl浸泡30min，用蒸餾水洗凈，直至pH.6.

34、0左右，抽干；,(4)PBS（0.0175M pH6.7）浸泡3hr； (5)傾去微細(xì)顆粒（浮懸），加入PBS（0.0175M pH6.7）使容積為沉淀體積的1.5倍； 2. 關(guān)閉柱的出口，向柱內(nèi)加入1/3體積的PBS （0.0175M pH6.7）,將DEAE32－cellulose懸浮液 用玻棒引流連續(xù)倒入柱內(nèi)，當(dāng)交換劑沉積到底部時(shí)，打開流出口，讓緩沖液緩慢流出，再倒入更多的懸

35、液，直至整個(gè)用量加完為止； 3. 將柱與儲(chǔ)液瓶（內(nèi)盛同樣PBS）連接，流洗幾個(gè)柱體積的緩沖液，使柱床穩(wěn)定，并使得流出液pH為6.7；,4. 純化γ-球蛋白：取實(shí)驗(yàn)3所保存溶液（γ-球蛋白），再對(duì)PBS（0.0175M pH6.7）透析12-24hr，更換數(shù)次PBS，使蛋白質(zhì)溶液中pH為6.7； 5. 將透析后的粗提IgG樣品緩緩加在柱床頂部，打開出水口，待樣品全部進(jìn)入柱床后，緩慢流入PBS（0.0

36、175M pH6.7），調(diào)整流速至0.3ml/min，開始用Eppendorf管收集洗脫液，每管1ml，先用磺酰水楊酸檢測(cè)有無蛋白質(zhì)流出（蛋白質(zhì)遇磺酰水楊酸顯白色，故用黑色比色板），待蛋白質(zhì)流出后，迅速收集蛋白液（視收集量和蛋白質(zhì)的濃度可選擇用30%PEG濃縮）。此不被吸附的即為純化的γ-球蛋白；,6. 將收集到的蛋白液合并，紫外分光光度計(jì)法(見實(shí)驗(yàn)1)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，取部分溶液進(jìn)行純度鑒定、分子量和等電點(diǎn)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)；

37、 7. 用完的凝膠柱用1M NaCl流洗干凈，再用0.02M NH4Ac緩沖液（pH6.5）流洗平衡后可重復(fù)使用，但應(yīng)將頂部吸去并新添，暫不用時(shí)可將其倒出，浸于1%正丁醇的緩沖液中，以防霉變。,8. 純化白蛋白 取上一實(shí)驗(yàn)所保存溶液（白蛋白）, 再對(duì)PBS（0.0175M pH6.7）透析24hr，更換數(shù)次PBS，使蛋白質(zhì)溶液中pH為6.7；透析后白蛋白樣品上柱后，改用 0.06 mol/L NH4Ac 緩沖液（pH6

38、.5）洗滌，流出約 30 ml（其中含α–及β–球蛋白）后，將柱上的緩沖液面降至與纖維素床表面平齊。然后改用0.3 mol/L NH4Ac 緩沖液 （pH6.5）洗脫，并用20%磺基水楊酸檢查流出液是否含有蛋白質(zhì)。由于純化的白蛋白仍然結(jié)合有少量膽色素等物質(zhì)，故肉眼可,見一層淺黃色的成分被0.3 mol/L NH4Ac 緩沖液洗脫下來，大約改用 0.3 mol/L NH4Ac 洗脫約 4 ml時(shí)，即可試出有蛋白質(zhì)白色混濁，立即連續(xù)收集3管

39、，每管10滴，此即為純化的白蛋白液，取其中蛋白質(zhì)濃度高的兩管留作含量測(cè)定和純度鑒定用（視收集量和蛋白質(zhì)的濃度可選擇用30%PEG濃縮）。用過的DEAE–cellulose層析柱，應(yīng)重新再生平衡，方法如下，先用20 ml 1.5 mol/L NaCl– 0.3 mol/L NH4Ac流洗，再用 40 ml 0.02 mol/L NH4Ac（pH6.5）流洗平衡即可。暫不用時(shí)可將其倒出，浸于1%正丁醇的緩沖液中，以防霉變。,【注意事項(xiàng)】

40、 1. 裝柱時(shí)柱子一定要垂直； 2. 裝柱時(shí)應(yīng)注意，柱床內(nèi)不得產(chǎn)生界面、氣泡，表面要平整； 3. 柱子用完后一定要用高濃度的鹽溶液洗凈。,實(shí)驗(yàn)四 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。2.掌握垂直板電泳的操作方法。3.運(yùn)用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。,【基本原理】,聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的分辨率，用

41、它分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白組分的分子大小和形狀以及所帶電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差別。將已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知相對(duì)分子量的蛋白質(zhì)樣品，在相同的條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得它的相對(duì)分子量。也可以用相關(guān)分析軟件得出回歸方程并計(jì)算出結(jié)果。,【儀器、材料與試劑】（一）儀器 1. 電泳儀 2．垂直平板電泳槽 3．微量進(jìn)

42、樣器（二）材料 1. IgG： 2.血清,（三）試劑 1. 凝膠貯液：丙稀酰胺（Acr）30g、雙丙稀酰胺（Bis）0.8g，ddH2O溶解，定容至100ml。 2. 0.05M pH8.0 Tris-HCl緩沖液：0.61 gTris加入 50ml ddH2O使之溶解，再加入3ml 1M HCl溶液，混勻后在pH計(jì)上調(diào)pH至8.0，最后加ddH2O定容至100ml。

43、 3. 分離膠緩沖液：Tris 36.3g加入1M HCl溶液48.0ml，再加ddH2O到100ml，pH8.9。,4. 電極緩沖液：3 g Tris、14.4 g甘氨酸、1g SDS，ddH2O定容至1000ml。 5. 樣品緩沖液：1.0ml甘油、0.1ml巰基乙醇、100mgSDS、2mg溴酚藍(lán)、2ml Tris-HCl （pH8.0） 緩沖液，ddH2O定容至10ml。 6. 過硫酸銨

44、（AP）溶液：1gAP溶于10ml ddH2O中（要求現(xiàn)用現(xiàn)配）。 7. 四甲基乙二銨（TEMED）。,8. 染色液：1.25 g 考馬斯亮蘭 R-250，溶于500ml固定液中，混勻。 9. 脫染液：75mL冰醋酸、50mL甲醇、875ml水，混勻。 10. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白（次高分子量）。 11. 濃縮膠緩沖液：Tris 5.98g加1M HCl 溶液48.0ml，加

45、ddH2O到100ml，pH6.7。 12. 固定液：取50%甲醇454mL，冰醋酸46ml混勻。,【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 將電泳槽玻璃板洗凈，吹干，安裝好；用1%的瓊脂糖電泳緩沖液（1g瓊脂糖溶于100ml電泳緩沖液）封嚴(yán)玻璃板的邊和底（保證不漏膠/新式電泳槽此步免）； 2. 配分離膠（2.5mlTris（pH8.9）＋3.3ml凝膠溶液＋4.2ml蒸餾水，50μl-10%SDS溶

46、解，混勻后再加入50µl AP和10µl TEMED，混勻）; 3. 將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內(nèi)，至凝膠槽高三分之二處，加1~2cm高的蒸餾水密封。待膠凝固后（約需30min）倒掉水，用吸水紙吸干；,配濃縮膠（1.25mlTris（pH6.7）＋0.85ml凝膠溶液＋2.95ml蒸餾水，20μl-10%SDS溶解，混勻后再加入25μl AP和10µl TEMED，混勻），將配好的濃縮膠

47、立即倒入凝膠槽（插入梳子不溢出為宜），插入梳子；,對(duì)于不同分子量樣品建議使用的凝膠濃度,4. 待膠凝固后，拔出梳子，加入電泳緩沖液（淹沒膠，但不高于電泳槽）； 5. 樣品處理：取標(biāo)準(zhǔn)蛋白或樣品10-20µl，加入10-20μl樣品緩沖液，混勻，100℃水浴加熱3~5min。 6. 進(jìn)樣：將處理好的樣品10µl加入到凝膠孔中，連接電泳儀； 7. 電泳：打開電源，

48、調(diào)整電壓至100V，開始電泳，待樣品全部進(jìn)入凝膠后，將電壓調(diào)至120V，待指示劑（溴酚蘭）到達(dá)凝膠的底部,距離下緣1cm時(shí)停止電泳，取下玻璃板，小心地把其中一塊玻璃板從凝膠上取下來，測(cè)量分離膠的長(zhǎng)度及分離膠上沿至溴酚藍(lán)帶中心的距離，記錄于表中，或者在溴酚藍(lán)帶的中心插入一段細(xì)銅絲以標(biāo)出染料的位置，取出分離膠（注意保持膠的完整性）； 8. 固定：將膠置于固定液中浸泡30min； 9. 染色：將分離膠浸入染色

49、液中染色30min；,10. 脫染：取出分離膠，先用蒸餾水漂洗一次，浸入脫染液中脫染，室溫浸泡凝膠或37℃加熱使其脫色，更換幾次脫色液，直至出現(xiàn)清晰的電泳帶為止； 11. 將膠片小心放置于一塊玻璃板上，分別測(cè)量分離膠的長(zhǎng)度、樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的泳動(dòng)距離（分離膠上沿至各蛋白區(qū)帶中線的距離）； 12. 凝膠照相；,13、電泳遷移率的計(jì)算 （1）不插銅絲的計(jì)算方法：遷移率=（蛋白質(zhì)移動(dòng)距離 / 染料移動(dòng)距離）

50、15;（染色前膠長(zhǎng) / 脫色后膠長(zhǎng)） （2）插銅絲的計(jì)算方法：遷移率= 蛋白質(zhì)移動(dòng)距離 / 染料移動(dòng)距離,14、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品遷移率做橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量作縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，即可得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（也可取蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)值用一般坐標(biāo)紙作圖）。測(cè)得待測(cè)蛋白質(zhì)的遷移率后，由曲線上即可查出其分子量。,【注意事項(xiàng)】 1． 丙烯酰胺具有中等毒性.常人每天允許的最大暴露量不超過0.5μg/kg,

51、皮膚接觸可致中毒,癥狀為紅斑,脫皮,眩暈,動(dòng)作機(jī)能失調(diào),四肢無力等. 2．沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近，一定要催化充分,使之完全聚合，集中處理,實(shí)驗(yàn)中全部的膠由專門受過訓(xùn)練的人收集到一起,在一個(gè)特殊標(biāo)明的容器中保存,并進(jìn)一步催化使之反應(yīng)完全,最后送交學(xué)校危險(xiǎn)品倉(cāng)庫,統(tǒng)一處理. 3．待測(cè)樣品如果蛋白含量低于1mg/mL，處理之前應(yīng)先濃縮至1mg/mL；若高于1mg/mL，處理之前應(yīng)先稀釋至1mg/mL。

52、,【思考題】 1. 在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么? 2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用? 3. 在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用? 4. 樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘?,實(shí)驗(yàn)五 等點(diǎn)聚焦測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1. 掌握凝膠等電聚焦的基本原理。

53、 2. 學(xué)習(xí)用等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的操作和方法。,【實(shí)驗(yàn)原理】,蛋白質(zhì)（酶）、多肽等兩性電解質(zhì)，其所帶電荷的數(shù)量與性質(zhì)，隨所處環(huán)境的pH而變化。環(huán)境pH低于其等電點(diǎn)時(shí)，帶正電荷，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)；環(huán)境pH高于其等電點(diǎn)時(shí)，帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)；環(huán)境pH等于其等電點(diǎn)時(shí)，不帶電荷，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。據(jù)此，在電泳系統(tǒng)中創(chuàng)造一個(gè)由陽極向陰極，pH由低到高的連續(xù)而穩(wěn)定pH梯度環(huán)境，那么處在這種系統(tǒng)中具有不同等電點(diǎn)的

54、各種蛋白質(zhì)，將根據(jù)所處環(huán)境的pH與其自身等電點(diǎn)的差異，分別帶上正電荷或負(fù)電荷，并向與它們各自的等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H環(huán)境位置處移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)該位置時(shí)即停止移動(dòng)，從而各自焦聚（聚焦），分別形成一條集中的蛋白質(zhì)區(qū)帶。這種根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同而將它們分開的電泳方法稱為等電聚焦電泳。電泳后測(cè)定其各種蛋白質(zhì)“聚焦”部位的pH，即可得知它們的等電點(diǎn)。,（一）儀器 1. 電泳儀 2．垂直平板電泳槽(園盤電泳)（二）材料

55、 1. IgG： 2. 血清（三）試劑 1. 兩性電解質(zhì)Ampholine，pH 3~10，濃度40%。 2. 丙烯酰胺（Acr）溶液：Acr 30g ，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）1.0g，蒸餾水溶解后定容至100ml，過濾，4℃保存。,3. TEMED4．10% AP溶液：臨用時(shí)配制。5．正極緩沖液：0.2%(V/V)硫酸或磷酸。(85%磷酸29.4ml配成500

56、ml)6．負(fù)極緩沖液：0.5%(V/V)乙二胺水溶液。(NaOH10g配成500ml)7．固定液：10%(W/V)三氯乙酸。8．染色液：考馬斯亮藍(lán)R250 2.0 g以50%甲醇 1000ml溶解。使用時(shí)取93ml，加入7.0ml冰醋酸，搖勻即可使用。9．脫色液：按5份甲醇、5份水和1份冰醋酸混合即可。,【實(shí)驗(yàn)步驟】,凝膠制備：按下表配制7.5 %凝膠。 水：7.0ml 3

57、0%凝膠儲(chǔ)液：2.5ml Ampholine：0.3ml 蛋白質(zhì)樣品：0.1ml AP（10%）：0.05ml TEMED：0.01ml,吸取丙烯酰胺凝膠儲(chǔ)液，AP和水于50ml的小燒杯中混勻，在真空干燥器中抽氣10min（本實(shí)驗(yàn)將次步省略，并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。然后加入0.3ml Ampholine、0.1ml IgG待測(cè)樣品

58、和0.01ml TEMED溶液，混勻后立即制膠（方法同SDS-PAGE電泳），膠液加至距離頂部5mm處，在膠面上覆蓋3mm厚的水，應(yīng)注意不要讓水破壞膠的表面，室溫下放置20~30min即可聚合。為觀察聚焦?fàn)顩r，可在樣品中加入聚焦指示劑，如帶紅顏色的肌紅蛋白（PI=6.7）、細(xì)胞色素C（PI=10.25）或甲基紅染料（PI=3.75），以示聚焦的進(jìn)展情況。,2. 電泳：吸去凝膠表面上的水層，于電泳槽正極緩沖液加入0.2%的硫酸（或磷酸）

59、，負(fù)極加入0.5%的乙二胺（或乙醇胺/或NaOH）。打開電源，將電壓恒定為160V，因?yàn)榫劢惯^程是電阻不斷加大的過程，故聚焦電泳過程中，電流不斷下降，降至穩(wěn)定時(shí)，即表明聚焦已完成，繼續(xù)電泳約30min后，停止電泳。 3. 剝膠：電泳結(jié)束后，取下膠塊，分別于正負(fù)兩極做上標(biāo)記，切不可弄混，并測(cè)量出凝膠的長(zhǎng)度。,4. 固定、染色和脫色：固定液中浸泡30min ，然后轉(zhuǎn)移至脫色液中浸泡，換3次溶液，每次10min浸泡過程中不

60、斷搖動(dòng)，以除去Ampholine。量取并記錄漂洗后的膠長(zhǎng)。再把膠放置于染色液中，室溫染色30min，取出用蒸餾水洗后，放在脫色液中脫色，不斷搖動(dòng)，并更換3~5次脫色液，待本底顏色脫去，蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰時(shí)，量取并記錄凝膠長(zhǎng)度以及蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至正極端的距離。,5. pH梯度的測(cè)量：在未固定前將凝膠縱切為兩部分，一部分用于進(jìn)行第四步，另一部分（三條泳道即可）按從正極端向負(fù)極端的順序切成0.5cm的區(qū)段，按次序放入有標(biāo)號(hào)的、裝有1ml蒸餾水的

61、試管中，浸泡過夜，然后用精密pH試紙測(cè)出每管浸泡液的pH并記錄。有條件的實(shí)驗(yàn)室最好用精密pH計(jì)測(cè)定。,6、結(jié)果測(cè)定： （1）pH梯度曲線的制作：以膠長(zhǎng)（mm）為橫坐標(biāo)，各區(qū)段對(duì)應(yīng)的pH的平均值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條近似直線的PH梯度曲線。由于測(cè)得的每一管的pH是5mm長(zhǎng)一段凝膠各點(diǎn)pH的平均值，因此作圖時(shí)可把此pH視為5mm小段中心區(qū)的pH，于是第一小段的pH所對(duì)應(yīng)的凝膠長(zhǎng)度為2.5mm；第二小段的PH所對(duì)應(yīng)的

62、凝膠長(zhǎng)度為（5×2－2.5）mm；由此類推，第n小段的PH所對(duì)應(yīng)的凝膠長(zhǎng)度為（5n－2.5） mm。,（2）待測(cè)蛋白樣品等電點(diǎn)的計(jì)算： ①按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠正極端的實(shí)際長(zhǎng)度（Lp表示）： Lp=lp×l1 / l2式中 lp——染色后蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至凝膠正極端的長(zhǎng)度l1——凝膠固定前的長(zhǎng)度l2——凝膠染色后的長(zhǎng)度 ②根據(jù)上

63、式計(jì)算待測(cè)蛋白的Lp，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對(duì)應(yīng)的pH，即為該蛋白的等電點(diǎn)。,【注意事項(xiàng)】 1. 鹽離子可干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進(jìn)行IEF-PAGE時(shí)，樣品應(yīng)透析或用SephadexG-25脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。 2. 加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目以及檢測(cè)方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，加樣量可為50-1

64、50?g；如用銀染色，加樣量可減少到1?g。一般樣品濃度以0.5-3 mg/mL為宜，最適當(dāng)加樣體積為10-30?l。,3. 通常，窄范圍的pH梯度可以提高分辨率，但是需要時(shí)間也比較常，pH梯度范圍為2是較好的選擇。 4. 由于電源和凝膠冷卻系統(tǒng)的限制，最長(zhǎng)的凝膠長(zhǎng)度為8－10cm，實(shí)際上，分別電泳幾塊不同的pH梯度的凝膠比只電泳一塊較長(zhǎng)凝膠效果更好。 5. 在變性液中加入2％Triton X－

65、100以保證蛋白質(zhì)（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如CHAPS和Zwittergent3－14等兩性離子去垢劑。,【思考題】,1．凝膠等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的原理？ 2. 凝膠等電聚焦電泳法操作時(shí)應(yīng)注意的問題？,實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒的分離與純化,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法分離提取質(zhì)粒。,【實(shí)驗(yàn)原理】,堿裂解法去、提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上

66、的差異來分離它 們。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性 的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變形，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤旋，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入ph4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀

67、下來而被除去。,【儀器、材料與試劑】,（一）儀器 恒溫培養(yǎng)箱；恒溫?fù)u床；臺(tái)式離心機(jī)；高壓滅菌鍋（二）材料 1. 葡萄糖 2. 三羥甲基氨基甲烷 3. 已二胺四乙酸 4. 氫氧化鈉,5. 十二烷基硫酸鈉6. 乙酸鉀7. 冰乙酸8. 氯仿9. 乙醇10. 胰RNA酶11. 氨芐青霉素12. 蔗糖,13. 溴酚藍(lán)14. 酚15. 8-羥基喹啉16. 巰基乙醇

68、17．鹽酸18. puC19質(zhì)粒的大腸桿菌20. 吸頭、小指管,（三）試劑 1. 溶液Ⅰ 50mmol/l 葡萄糖 25mmol/l 三羥甲基氨基甲烷 10mmol/l乙二胺四乙酸 2. 溶液Ⅱ 0.4mol/l 氫氧化鈉，2%SDS用前等體積混合

69、 3. 溶液Ⅲ,5mol/L乙酸鉀 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 4. TE緩沖液 10mmol/L Tris.Hcl(PH8.0) 1mmol/L Edta(PH8.0)