實驗三、細菌的生化鑒定

1、常用細菌鑒定技術(shù),實驗目的,掌握細菌的基本鑒定技術(shù),細菌的基本鑒定技術(shù),生化反應鑒定：通過觀察細菌利用酶和降解糖類、醇類、脂類、蛋白質(zhì)和氨基酸的能力可以了解其生化活性，從而識別和鑒定細菌。免疫學鑒定（血清學鑒定）編碼鑒定,實驗內(nèi)容—生化反應鑒定,（每2人一組）：1、糖（苷、醇）利用試驗：乳糖分解利用試驗2、氧化酶試驗3、過氧化氫酶試驗4、克氏雙糖鐵（KIA）5、半固體（M）（這個實驗已做過，本次不做）6、吲哚試驗（I）

2、7、尿酶試驗（U）,一、糖（苷、醇）利用試驗：乳糖分解利用試驗,【原理】 不同的細菌對不同的糖（苷、醇）的分解能力不同，有的分解，有的不能分解，有的分解后能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解后僅能產(chǎn)酸，因此可以用來鑒別細菌。 以乳糖分解利用為例，乳糖發(fā)酵管中含溴甲酚紫指示劑，當細菌分解乳糖產(chǎn)酸，培養(yǎng)基pH下降，指示劑變黃色，不分解乳糖的指示劑不變色。,乳糖分解利用試驗,菌種：大腸桿菌、變形桿菌培養(yǎng)基：乳糖發(fā)酵管方法：

3、1、取2支乳糖發(fā)酵管，用記號筆分別標記大腸桿菌和變形桿菌。2、按細菌的液體接種法，將大腸桿菌和變形桿菌分別接種到乳糖發(fā)酵管中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h。,乳糖分解利用試驗,結(jié)果觀察,乳糖發(fā)酵管中含溴甲酚紫指示劑，當 pH值>6.8時呈紫色，pH值<5.2時呈黃色，當細菌分解利用乳糖，產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基的pH值變小，呈黃色。如細菌不能分解乳糖，則乳糖發(fā)酵管仍為紫色。 接種大腸桿菌的乳糖發(fā)酵管變?yōu)辄S色，接種變形桿菌的乳

4、糖發(fā)酵管仍是紫色。說明大腸桿菌能夠分解乳糖，變形桿菌不能分解乳糖。 乳糖發(fā)酵管中如果有小導管，還可以觀察產(chǎn)氣情況。大腸桿菌能夠分解利用乳糖，產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，小導管中有氣泡產(chǎn)生。,氧化酶試驗,【原理】 氧化酶又稱細胞色素氧化酶，能將還原型細胞色素C氧化形成水和氧化型細胞色素C，氧化型細胞色素C再使四甲基對苯二胺氧化，形成顯色反應。,氧化酶試驗,【試劑與器材】1．菌種 大腸埃希菌、銅綠假單胞菌2．試劑 氧化酶試劑（

5、1%四甲基對苯二胺）3．器材 2cm×2cm濾紙片、污物缸,氧化酶試驗,【操作步驟】1．將濾紙片疊成四方塊狀。2．用濾紙片的中心尖角小心刮取大腸埃希菌菌落，注意不可碰到培養(yǎng)基。3．輕輕展開濾紙片，刮取的菌落正好在濾紙片中心，滴加一滴1%四甲基對苯二胺。4．立刻觀察菌落顏色的變化。5．同法做銅綠假單胞菌的氧化酶試驗。,氧化酶試驗,【結(jié)果】 滴加氧化酶試劑后銅綠假單胞菌立刻變?yōu)樽仙?，為氧化酶陽性。大腸埃希菌

6、不變色，為氧化酶陰性。,氧化酶試驗（左側(cè)為銅綠假單胞菌、右側(cè)為大腸埃希菌）,氧化酶試驗,【注意事項】1．實驗中的菌種要求新培養(yǎng)的，不宜用陳舊的培養(yǎng)物。2．刮取細菌時不可碰到培養(yǎng)基，不可用接種環(huán)等金屬物品取菌。3．氧化酶試劑要新鮮配制，一般裝在棕色瓶中，放在冰箱中可保存一周，時間長了易被空氣氧化變色。4．結(jié)果要立刻觀察，1min內(nèi)變色者為陽性，超過1min變色的為陰性。5．在濾紙片上滴加試劑時不要過多，以剛潤濕紙片為宜，如濾紙片

7、過濕，可能妨礙空氣與細菌接觸，延長反應時間，造成假陰性。,過氧化氫酶試驗,【原理】 過氧化氫酶試驗又稱觸酶試驗。部分細菌含有黃素蛋白，在代謝過程中與空氣中的氧發(fā)生反應，形成過氧化氫，過氧化氫對細菌有毒害作用，會破壞細胞組分，因此，細菌為保護自己，通常具有過氧化氫酶，可以催化裂解過氧化氫，形成水和氧氣。,過氧化氫酶試驗,【試劑與器材】1、菌種 金黃色葡萄球菌2、試劑 3%過氧化氫3、器材 載玻片、無菌移液器吸

8、頭、酒精燈、火柴、超凈工作臺,過氧化氫酶試驗,【操作步驟】1、在載玻片中央滴加一滴3%過氧化氫。2、用無菌移液器吸頭蘸取少量細菌，在3%過氧化氫中混勻。【結(jié)果】 觀察氣泡的產(chǎn)生情況。可以看見在吸頭上金黃色葡萄球菌菌苔周圍，產(chǎn)生大量氣泡，為過氧化氫酶陽性。如果菌苔周圍無氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶陰性。,過氧化氫酶試驗,【注意事項】1、普通金屬接種環(huán)可能與過氧化氫反應，形成氣泡，造成假陽性，因此必須使用鉑絲接種環(huán)或塑料、玻璃材質(zhì)的

9、工具。2、從血液瓊脂平板上挑取菌落時千萬小心，不要碰到培養(yǎng)基，因紅細胞中有過氧化氫酶，即使一點點也會造成假陽性。3、過氧化氫試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。,克氏雙糖鐵（KIA）,原理：克氏雙糖鐵（KIA)主要用于革蘭陰性桿菌的鑒別，分解乳糖的細菌斜面為黃色，分解葡萄糖的細菌底層為黃色，產(chǎn)生硫化氫的細菌培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色。此外還可以觀察細菌分解葡萄糖是否產(chǎn)氣。,克氏雙糖鐵（KIA）,【試劑與器材】1、菌種 大腸埃希菌、變形桿菌2、器材 克氏

10、雙糖鐵（KIA）、接種針、酒精燈、火柴、記號筆、試管架、37℃恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺。【操作步驟】1．取2支克氏雙糖鐵（KIA），用記號筆分別標記大腸埃希菌、變形桿菌。2．按細菌的斜面接種法，將大腸埃希菌、變形桿菌分別接種到相應的管中。3．放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h。,克氏雙糖鐵（KIA）,結(jié)果觀察：觀察上部和下部的顏色變化，變黃為產(chǎn)酸，變紅為產(chǎn)堿，有氣泡為產(chǎn)氣，有黑色為產(chǎn)硫化氫。大腸桿菌結(jié)果：A/A,產(chǎn)氣變形桿菌結(jié)果：K

11、/A,產(chǎn)大量硫化氫。,吲哚試驗,【原理】 吲哚試驗又稱靛基質(zhì)試驗。某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚、丙酮酸、氨。加入吲哚試劑對二甲基氨基苯甲醛，與吲哚結(jié)合，形成玫瑰色的吲哚化合物。,吲哚試驗,【試劑與器材】1．菌種 大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌2．試劑 吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛1g，95%乙醇95ml，濃鹽酸20ml配制）3．器材 蛋白胨水培養(yǎng)基、接種針或接種環(huán)、酒精燈

12、、火柴、記號筆、試管架、37℃恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺。,吲哚試驗,【操作步驟】1．取2支蛋白胨水培養(yǎng)基，用記號筆分別標記大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。2．按液體接種法，將2菌分別接種于蛋白胨水中。3．置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h，取出，分別滴加2~3滴吲哚試劑，輕搖試管，試劑浮于液面，觀察顏色變化。,吲哚試驗,【結(jié)果】 接種大腸埃希菌的試驗管中，吲哚試劑變成玫瑰紅色，為吲哚試驗陽性。接種產(chǎn)氣腸桿菌的試驗管中，吲哚試劑不

13、變色，為吲哚試驗陰性。,尿酶試驗（U）,【原理】 某些細菌可以產(chǎn)生尿酶來水解尿素，可以利用含有尿素的培養(yǎng)基和pH指示劑（如酚紅）來檢測。尿素被尿酶水解，產(chǎn)生氨、二氧化碳、水，使培養(yǎng)基變堿，酚紅變?yōu)樯罘奂t色。,尿酶試驗（U）,【試劑與器材】1、菌種 大腸埃希菌、普通變形桿菌2、器材 尿素培養(yǎng)基、接種針或接種環(huán)、酒精燈、火柴、記號筆、試管架、37℃恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺。,尿酶試驗（U）,【操作步驟】1、取2支尿素培

14、養(yǎng)基，用記號筆分別標記大腸埃希菌和普通變形桿菌。2、按液體接種法，將2菌分別接種于尿素培養(yǎng)基中。3、置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—48h，取出，觀察顏色變化。,尿酶試驗（U）,【結(jié)果】 接種大腸埃希菌的試驗管為黃色，說明大腸埃希菌不產(chǎn)生尿酶，尿酶試驗陰性。接種普通變形桿菌的試驗管變?yōu)樯罘奂t色，說明普通變形桿菌能產(chǎn)生尿酶，分解尿素，尿酶試驗陽性。,實驗內(nèi)容—生化反應鑒定,（每2人一組）：1、糖（苷、醇）利用試驗：乳糖分解利用試