浙大生化實(shí)驗(yàn)一

1、1實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲）指導(dǎo)老師：成績：__________________實(shí)驗(yàn)名稱：蔗糖酶的提取及離子交換柱層析分離純化蔗糖酶實(shí)驗(yàn)類型：生化實(shí)驗(yàn)同組學(xué)生姓名：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笠?、?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)掌握蔗糖酶的提取、分離純化

2、的基本原理和方法。2、學(xué)習(xí)離子交換層析的基本原理；3、學(xué)習(xí)離子交換層析分離蛋白質(zhì)的基本方法和技術(shù)；4、學(xué)習(xí)蔗糖酶活性檢測的基本原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理1、酵母細(xì)胞破碎本實(shí)驗(yàn)采用研磨的方法。通過固體剪切法（研磨）將酵母細(xì)胞破碎，把蔗糖酶從酵母細(xì)胞中提取出來。2、蔗糖酶的初步分離純化蛋白酶常用的初步分離純化方法有：鹽析、選擇性變性、有機(jī)溶劑沉淀等。本實(shí)驗(yàn)采用選擇性變性（加熱）、有機(jī)溶劑（乙醇）沉淀等方法對蔗糖酶進(jìn)行初

3、步的提純。由于酶蛋白在分離純化過程中易變性失活，為了能獲得盡可能高的產(chǎn)率和純度，在提純操作中要始終保持酶的活性，如在低溫下操作等，這樣才能收到較好地分離提純效果。3、離子交換層析離子交換層析是常用的層析方法之一。它是以離子交換劑為固定相，根據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換劑與流動(dòng)相中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對溶液中

4、離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。在某一pH值的專業(yè)：生物科學(xué)姓名：學(xué)號：日期：地點(diǎn)：裝訂線34、托盤天平（離心管平衡用）；5、高速冷凍離心機(jī)；6、恒溫水浴箱；7、制冰機(jī)；8、1.5ml離心管；9、－20℃冰箱；10、層析柱（φ1.020㎝）(1支組）；11、恒流泵（流速0.8～1mlmin）(10rpm)（1臺組）；12、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套組）；13、核酸蛋白檢測儀（靈敏度0.5A）（1臺組）；14、記錄儀（紙速：0.

5、5mmmin；靈敏度：50mV）（1臺組）；15、部分收集器及收集試管（1臺組）；16、鐵架臺、夾子（固定層析柱用）（1套組）；17、－20℃冰箱；18、試管、試管架等。五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟1、酵母細(xì)胞破碎稱取市售干酵母粉10g，約35g石英砂放入研缽中直接干燥充分研磨至盡可能成細(xì)粉末狀（約15分鐘），量取總體積3040ml的20mmolLTrisHClpH7.3緩沖液，分2次加在研砵內(nèi)研磨10分鐘，使呈糊狀液體

6、（研磨越徹底，釋放出的蔗糖酶越多）；將糊狀液體轉(zhuǎn)移到2支50ml離心管中，兩支離心管平衡后，4℃、12000rmin離心15分鐘（這次離心分離掉酵母碎片和酵母），收集上清液并量出體積V1（樣品I）另留1ml上清液（樣品I）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量測定、蔗糖酶活力測定和SDSPAGE分析。2、熱處理：將上一步抽提液（樣品I），迅速放入50℃恒溫水浴中，保溫30分鐘，并用玻璃棒溫和攪拌抽提液（由于蔗糖酶相對耐熱，熱處理能除去