動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)畢業(yè)論文預(yù)答辯-血球蛋白粉來源鑒定及其酶解小肽對(duì)斷奶仔豬營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)研究

1、姓名：武艷軍導(dǎo)師：龔道清 教授專業(yè)：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué),血球蛋白粉來源鑒定及其酶解小肽對(duì)斷奶仔豬營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)研究,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,1,目錄,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,2,研究背景,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,3,1、動(dòng)物血液制品的生物安全性問題,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,4,一、動(dòng)物血液及血液制品本身存在一定量的病毒 Polo 等（2005）證實(shí)在噴霧干燥

2、血漿和血球蛋白粉中有一定數(shù)量的病毒存在 Roodik等（2006）研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物血液制品中病毒數(shù)量大于百萬分之一的情況下有傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn) （宰前宰后檢疫、噴霧干燥、超濾納濾、ERP、PRS）二、動(dòng)物血源管理混亂，易混入牛羊源性成份，增加瘋牛病等疾病傳播機(jī)率（中國(guó)屠宰前3強(qiáng)：5%，美國(guó)屠宰前4強(qiáng)：50%，荷蘭前3強(qiáng)：74%，丹麥最大企業(yè)：80%）,1、動(dòng)物血液制品的生物安全性問題,2024/2/28,動(dòng)物科

3、學(xué)與技術(shù)學(xué)院,5,早期斷奶仔豬由于生理和免疫功能發(fā)育不完善，容易受到營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境、心理等多種應(yīng)激影響而引發(fā)“早期斷奶應(yīng)激綜合癥(PRAD)”，給畜牧業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。,2、“仔豬早期斷奶應(yīng)激綜合癥”及其解決方案,圖2 仔豬早期斷奶應(yīng)激綜合癥,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,6,,2、“仔豬早期斷奶應(yīng)激綜合癥”及其解決方案,傳統(tǒng)解決方案：抗生素、藥物添加劑（耐藥性、藥物殘留、微生物區(qū)系的破壞）Funderburke（19

4、90）：心理、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激中營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激最大營(yíng)養(yǎng)解決方案之一：選用對(duì)消化道發(fā)育阻礙小的生物活性物質(zhì)來配制斷奶仔豬日糧,圖3 生物活性物質(zhì),2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,7,三、小肽營(yíng)養(yǎng)在早期斷奶仔豬上的研究進(jìn)展,斷奶仔豬日糧中添加小肽可顯著提高平均日增重和采食量，降低料重比和腹瀉率，一定程度緩解和治療“早期斷奶應(yīng)激綜合癥”。王賢勇，王彬，鄭云峰(2006)；張常明(2007)；楊維仁，周紹，祝平等(2008)通過3

5、種方式生產(chǎn)的植物小肽對(duì)生產(chǎn)性能和血液生化指標(biāo)無顯著影響。孫占田等(2007)目前研究較多的是植物小肽，關(guān)于動(dòng)物小肽（血液小肽）還主要停留在工藝研究階段，對(duì)于作用機(jī)理及最佳添加量研究的很少。,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,8,研究目的,建立一套PCR鑒別動(dòng)物血球蛋白粉來源的技術(shù)研究酶解血球小肽對(duì)早期斷奶仔豬的營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng),2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,9,試驗(yàn)一、PCR鑒別動(dòng)物血球蛋白粉來源方法建立,202

6、4/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,10,牛、雞和混合血球蛋白粉由國(guó)家飼料檢測(cè)中心武漢分中心提供；豬血球蛋白粉為上海杰隆生物制品有限公司提供；同時(shí)還在市場(chǎng)上抽檢部分豬血球蛋白粉樣品。,表1 試驗(yàn)所用引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度,試驗(yàn)材料,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,11,試驗(yàn)結(jié)果和分析,1、樣品DNA提取和PCR測(cè)序結(jié)果,表2 樣品DNA提取和PCR測(cè)序結(jié)果,飼料中DNA提取方法主要有4種:Chelex法、SDS法、GuSCN

7、法和試劑盒法DNA提取方法在2種物種間是穩(wěn)定的，3對(duì)特異性引物可較為準(zhǔn)確的擴(kuò)增出目的片段,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,12,,圖1 檢測(cè)靈敏度分析A為豬血球蛋白粉靈敏度檢測(cè)；B為雞血球蛋白粉靈敏度檢測(cè)；C為牛血球蛋白粉靈敏度檢測(cè)；1、2、3、4分別為加入量為1.0 %、0.5 %、0.1 %和0.05 %的血球蛋白粉。,2、靈敏度檢測(cè)結(jié)果,楊寶華等（2001）采用GuSCN法提取DNA，檢測(cè)靈敏度為0.125 %；李林

8、等(2004)使用Promega公司的試劑盒提取DNA，檢測(cè)靈敏度為0.001 %本實(shí)驗(yàn)結(jié)果：0.05 %（動(dòng)物源性飼料檢測(cè)要求靈敏度≤ 0.1 % ）,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,13,圖2 雞、牛、豬的特異性引物樣品檢測(cè)PCR電泳圖1～5是用雞特異引物分別檢測(cè)雞、牛、豬、添加1%豬血球蛋白粉的混合血球蛋白粉和添加10%豬血球蛋白粉的混合血球蛋白粉，6～10是用牛特異性引物檢測(cè)以上5種血球蛋白粉，11～15是用豬特異

9、性引物檢測(cè)以上5種血球蛋白粉。M為分子量標(biāo)記。,3、特異性檢測(cè)結(jié)果,試驗(yàn)中所選用的3對(duì)引物可以較為準(zhǔn)確的擴(kuò)增出所需的目的片斷，但是在用牛特異性引物檢驗(yàn)雞血球粉時(shí)，有微弱的陽(yáng)性。 血球蛋白粉樣品是使用同一個(gè)噴霧干燥塔按照先牛后雞的順序生產(chǎn)，制備過程中混雜所致。,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,14,,,圖3 市場(chǎng)產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果1～3為用豬、牛、雞引物檢測(cè)樣品1，4～6是用豬、牛、雞引物檢測(cè)樣品2，7～9是用豬、牛、雞引物檢測(cè)樣

10、品3，10～12是用豬、牛、雞引物檢測(cè)樣品4，13～15是用豬、牛、雞特異引物檢測(cè)樣品5，M為分子量標(biāo)記。,4、市場(chǎng)產(chǎn)品抽檢結(jié)果,,,隨著政府立法對(duì)動(dòng)物源性飼料使用的規(guī)范以及PCR檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，豬血球蛋白粉中已經(jīng)很少添加反芻動(dòng)物血球蛋白粉，但仍有部分廠家的產(chǎn)品中會(huì)檢測(cè)出雞血球蛋白粉。,,,,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,15,試驗(yàn)二、酶解血球小肽對(duì)斷奶仔豬營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)研究,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,16,試驗(yàn)動(dòng)

11、物與日糧,選擇35日齡、體重胎次相近的“長(zhǎng)×大”二元去勢(shì)公豬160頭 基礎(chǔ)日糧由上海高得飼料有限公司生產(chǎn)，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1，試驗(yàn)組日糧為基礎(chǔ)日糧中添加0.5%、1.0%、2.0%的酶解血球小肽，通過制粒工藝加工而成。,表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成份表,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,17,試驗(yàn)設(shè)計(jì),,,,飼喂28天,每組選擇4頭仔豬采血,,血液生化指標(biāo),160頭仔豬隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組、0.5%、1

12、.0%、2.0%小肽組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭仔豬。,,消化道指標(biāo),,,小腸形態(tài)指標(biāo),,酶活性指標(biāo),PH值和器官指數(shù),,對(duì)照組和0.5%小肽組各取2只屠宰取樣,,生長(zhǎng)性能指標(biāo),,,,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,18,試驗(yàn)結(jié)果和分析,表2 酶解血球小肽對(duì)斷奶仔豬體重和平均日增重的影響,注：同一行中肩注相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，相同大寫字母表示差異

13、極顯著(P<0.01)，下表同。,1、酶解血球小肽對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,19,圖1 酶解血球小肽對(duì)斷奶仔豬平均日增重的影響,曹光辛(1998)鵪鶉、王碧蓮(2001)歐鰻、王賢勇（2007）仔豬研究相一致：合適的小肽添加量可提高生產(chǎn)性能，超過一定限度后生產(chǎn)性能差異不顯著，甚至效果更差。分析：隨著仔豬日齡的增加，過量的小肽在大腸后段發(fā)酵產(chǎn)生氨氣和有毒有害物質(zhì)，增加仔豬代謝負(fù)擔(dān)，降低其蛋白

14、利用率，從而影響生產(chǎn)性能。,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,20,圖2 酶解血球小肽在斷奶仔豬日糧中最適添加量,,X=0.623,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,21,表3 酶解血球小肽對(duì)斷奶仔豬平均日采食量、料重比和腹瀉率的影響,Miller（1984）、陳代文（1995）、張莉莉（2002）等學(xué)者一致認(rèn)為：仔豬腸道對(duì)日糧抗原產(chǎn)生過敏性是導(dǎo)致其腹瀉的原發(fā)性原因。 結(jié)果：小肽比植物蛋白有更低的過敏原性，利于斷奶仔豬

15、的吸收利用,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,22,表4 酶解血球小肽對(duì)早期斷奶仔豬血液生化指標(biāo)影響,2、酶解血球小肽對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響,血液生化指標(biāo)可以反映出機(jī)體各組織器管的代謝狀況，間接反映生長(zhǎng)性能：TP、ALG：蛋白代謝和免疫力；IgG:介導(dǎo)體液免疫；BUN：蛋白利用率ALT：與增重、飼料利用率呈一定程度正相關(guān)；LDH：與動(dòng)物抗應(yīng)激能力呈負(fù)相關(guān)結(jié)果：小肽可提高仔豬對(duì)蛋白利用率，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗應(yīng)激能力,2

16、024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,23,表5 酶解血球小肽對(duì)早期斷奶仔豬器官指數(shù)的影響,3、酶解血球小肽對(duì)斷奶仔豬消化道指標(biāo)的影響,結(jié)果：小肽組胸腺和頜下淋巴結(jié)指數(shù)顯著高于對(duì)照組，其它指標(biāo)差異不顯著分析：脾臟功能繁多，除了是免疫功能外，更是機(jī)體最大的濾血器管,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,24,表6 酶解血球小肽對(duì)早期斷奶仔豬腸道PH的影響,結(jié)果：小肽組和對(duì)照組差異不顯著，有一定程度的降低分析：小肽提高仔豬對(duì)蛋白的利

17、用率，減少腸道后段蛋白發(fā)酵和NH3產(chǎn)生，降低PH值,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,25,表7 酶解血球小肽對(duì)早期斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響,結(jié)果：小肽組十二指腸絨毛高度，空腸、回腸絨腺比顯著高于對(duì)照組，回腸隱窩深度顯著低于對(duì)照組。分析：小肽具有生理調(diào)節(jié)功能，能有效刺激和誘導(dǎo)小腸組織功能的上升，促進(jìn)小腸發(fā)育、成熟以及受損腸粘膜細(xì)胞的修復(fù)。,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,26,表8 酶解血球小肽對(duì)早期斷奶仔豬腸道酶活性

18、的影響,1、小肽組十二指腸淀粉酶、胰蛋白酶、蔗糖酶，空腸胰蛋白酶，回腸淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組。（PH、生理調(diào)節(jié)功能）2、脂肪酶差異均不顯著。（日糧脂肪水平影響）3、二糖酶的分布規(guī)律：粘膜高于內(nèi)容物，而粘膜中又以空腸最高。,2024/2/28,動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,27,研究結(jié)論,本研究建立了一套PCR鑒別動(dòng)物血球蛋白粉來源的方法，該方法DNA提取結(jié)果穩(wěn)定，引物準(zhǔn)確性和特異性較好，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.05%，對(duì)今后動(dòng)物血球蛋白粉

19、來源檢測(cè)既可以單獨(dú)使用也可以配伍其他方法進(jìn)行質(zhì)量控制。在日糧中添加不同水平的小肽，以0.5%小肽組綜合生產(chǎn)性能最佳，通過二次曲線得出斷奶仔豬日糧中小肽最佳添加量為0.623%。在日糧中添加0.5%的小肽可提高仔豬對(duì)蛋白質(zhì)的利用率，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)斷奶仔豬對(duì)各種應(yīng)激和疾病的抵抗力。本試驗(yàn)條件下，日糧中添加0.5%小肽可以促進(jìn)腸絨毛的發(fā)育和消化腺的成熟，一定程度上降低腸道的PH值，有利于斷奶仔豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。,