hpv檢測(cè)技術(shù)及臨床應(yīng)用

1、HPV檢測(cè)技術(shù)及臨床應(yīng)用,內(nèi)容,HPV檢測(cè)技術(shù)的誕生背景HPV檢測(cè)臨床應(yīng)用的進(jìn)展HPV檢測(cè)主要的技術(shù)及特點(diǎn)碩世21HPV分型定量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),HPV與宮頸癌關(guān)系的確立,Professor Harald zur HausenNobel Prize for Medicine 2008,1976年：Harald zur Hausen在宮頸癌及疣體患者中發(fā)現(xiàn)了HPV DNA；1984年：Harald zur Hausen從宮頸癌患者中克

2、隆了HPV16型和18型病毒。,“The first one who demonstrated HPV-DNA sequences in cervical cancer biopsies and cervical cancer cell lines.”,Cytology Reduced Cervical Cancer Incidence but Unmet Need Still Exists,http://seer.cancer.go

3、v/archive/csr/1975_2010/results_merged/sect_05_cervix_uteri.pdf: SEER 9 Incidence & U.S. Mortality 1975-2010, All Races, Females. Rates are Age-Adjusted. (accessed 3/25/14),細(xì)胞學(xué)減少了宮頸癌的發(fā)生率，但尚未滿足的需求依然存在,,對(duì)于CIN2及以上病變檢測(cè)的敏

4、感性，細(xì)胞學(xué)低于HPV DNA檢測(cè)1精確性差：不同的細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生之間或?qū)嶒?yàn)室之間對(duì)結(jié)果的判讀，存在高度的變異2只能分辨已經(jīng)處于癌或癌前病變的婦女，不能分辨具備發(fā)展為癌前病變的風(fēng)險(xiǎn)婦女,Castle PE, et al. Lancet Oncol 2011; 12:880–890 plus supplementary tables.Wright TC et al. Int J Cancer. 2013 Oct 7. doi: 10

5、.1002/ijc.28514. [Epub ahead of print],單獨(dú)使用細(xì)胞學(xué)的局限性,細(xì)胞學(xué)假陰性率高女性確診為浸潤(rùn)癌（ICC）的篩查史,1. Leyden WA, et al. J Natl Cancer Inst 2005; 97:675?683; 2. Andrae B, et al. J Natl Cancer Inst 2008; 100:622?629.,細(xì)胞學(xué)臨床敏感性明顯更低于HPV DNA檢測(cè),Wh

6、itlock EP, et al. Ann Intern Med. 2011; 155:687?697, W214?5.,Studies performed in developed countries in women 30 years and older.,,,,,,,,,,,,,平均增加了35.7%,,≥CIN2的檢測(cè)敏感性 (%),細(xì)胞學(xué)缺乏精確性細(xì)胞學(xué)的判讀重復(fù)性差,質(zhì)控（ QC ）評(píng)審診斷重讀了4948份液基細(xì)胞學(xué)片子

7、,原始診斷結(jié)果,Re-read of 4948 Liquid-based Cytology SlidesStoler M and Schiffman M, JAMA. 2001;285:1500-1505,,ASC-US和HSIL 的結(jié)果判讀一致性最差,,* For ≥CIN2Wright et al. Int. J. Cancer, 2014; 134(8):1835-43,,,,ATHENA 臨床研究: 細(xì)胞學(xué)在各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)

8、的變異很大,Khan et al. J Natl Cancer Inst. 2005; 97:1072-1079.,隨訪月數(shù),發(fā)展為≥CIN3的百分比,≥30歲，細(xì)胞學(xué)為NILM，10年≥CIN3的累計(jì)風(fēng)險(xiǎn),,13,229 women aged ≥30 years, according to oncogenic HPV status at enrollment,細(xì)胞學(xué)不能像HPV DNA檢測(cè)那樣，可預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)HPV DNA檢測(cè)確定了婦

9、女隨著時(shí)間CIN3以上病變的發(fā)展風(fēng)險(xiǎn),內(nèi)容,HPV檢測(cè)技術(shù)的誕生背景HPV檢測(cè)臨床應(yīng)用的進(jìn)展HPV檢測(cè)主要的技術(shù)及特點(diǎn)碩世21HPV分型定量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),,,1970s豪森提出HPV感染與宮頸癌有關(guān),美國(guó)宮頸癌死亡人數(shù)下降85%1941年，死亡26000人2010年，死亡4210人。,宮頸癌篩查重大進(jìn)展時(shí)間表,1. HPV聯(lián)合細(xì)胞學(xué)篩查（2012年ASCCP/ACS/ASCP）,Saslow D, Solomon D, Law

10、son HW et al. Am J Clin Pathol. 2012 Apr;137(4):516-42.,HPV檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)篩查（30歲及以上）,ASCCP，American Society for Colposcopy and Cervical Pathology：美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)CSCCP，China Society for Colposcopy and Cervical Pathology：中國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)

11、會(huì)LSIL，Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion)：低度鱗狀上皮內(nèi)病變,Saslow D et al, Journal of Lower Genital Tract Disease, 2012,HPV檢測(cè)+細(xì)胞學(xué),細(xì)胞學(xué)≥ LSIL,HPV+ & NILM,HPV- & ASC-US,HPV- & NILM,HPV+ & ASC-US,陰道鏡,間隔5年篩查,

12、ASCCP推薦：間隔3年篩查CSCCP推薦：間隔1年篩查,HPV16/18+,HPV16/18-,HPV16/18分型 立即,重復(fù)聯(lián)合檢測(cè)間隔12個(gè)月,HPV+ 或≥ ASC,HPV- & NILM,陰道鏡,間隔3年篩查,重復(fù)聯(lián)合檢測(cè)間隔12個(gè)月,2. 21歲及以上女性細(xì)胞學(xué)ASC-US的分流管理 (2013年ASCCP指南推薦),意義不明的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC-US）,陰性,≥ASC,常規(guī)篩查（3年內(nèi)細(xì)胞學(xué)檢

13、查）,陰道鏡 不充分陰道鏡檢查未觀察到上皮病變，首選頸管取樣 充分陰道鏡檢查轉(zhuǎn)化區(qū)有上皮病變，可接受頸管取樣,HPV陽性,HPV陰性,重復(fù)聯(lián)合檢測(cè)間隔 3年,參照ASCCP指南管理,重復(fù)細(xì)胞學(xué)，間隔 1年（可接受）,HPV檢測(cè)（首選）,L. Stewart Massad, et al, Journal of Lower Genital Tract Disease, 2013.,3. 25歲及以上女性HPV檢測(cè)宮頸癌一線初篩 (

14、2016年ACOG指南推薦),ACOG，American Congress of Obstetricians and Gynecologists：美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)NILM，negative for intraepithelial lesion or malignancy：未見上皮內(nèi)病變或惡性病變ASC-US，Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance：意義不明的非典型鱗

15、狀上皮細(xì)胞,2016 ACOG practice bulletin，Number 157.,HPV 檢測(cè)預(yù)防宮頸癌（歐洲試驗(yàn)結(jié)果）,4 個(gè)歐洲隨機(jī)試驗(yàn)，分別在瑞典、荷蘭、英國(guó)和意大利進(jìn)行包括 176,464位20-64歲婦女隨訪的中位年數(shù)為6.5 (1,214,415 人-年)HPV 初篩相比細(xì)胞學(xué)，減少了宮頸癌的發(fā)生率,Ronco et al. Lancet，2014,HPV檢測(cè)篩查宮頸癌的預(yù)防效果優(yōu)于細(xì)胞學(xué),Ronco e

16、t al. Lancet，2014,匯總四個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的宮頸癌發(fā)病率：細(xì)胞學(xué)（對(duì)照組）與HPV檢測(cè)（試驗(yàn)組）,美國(guó)ATHENA研究,研究人群：美國(guó)46,887位接受常規(guī)篩查的婦女 (其中32,260位 >30 歲，41955位 >25 歲)受檢者同時(shí)婦科檢查，液基細(xì)胞學(xué)檢查，HPV檢測(cè)和基因分型所有HPV (+) 和/或 細(xì)胞學(xué) (+)；和選取部分HPV (-) / NILM（未見上皮內(nèi)細(xì)胞病變）的人群行陰道鏡檢查,

17、比較不同篩查策略效能（25歲及以上女性）,,,,權(quán)衡CIN3+的檢出率和陰道鏡轉(zhuǎn)診率,Wright et al. Gynecol Oncol 2015,*混合策略是指25-30歲細(xì)胞學(xué)篩查策略結(jié)合30歲及以上HPV檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)篩查策略,宮頸癌發(fā)生率（每100,000）,年齡組,* http://seer.cancer.gov/csr/1975_2010/,,SEER 腫瘤登記(1975-2010)*,美國(guó)宮頸癌的發(fā)病率25 – 3

18、4 歲時(shí)快速上升期,SEER（Surveillance, Epidemiology, and End Results ）,Presented to FDA panel, 12 March 2014,Age Group,40%,30%,20%,10%,0%,25-29,40-49,30-39,>50,≥CIN3病例（%）,21-24,28%,17%,10%,37%,8%,,25%,N=22,006Women,N=6647Wom

19、en,28% 的≥CIN3 病例發(fā)生在25-29 歲年齡段,42.7,53.3,61.7,72.2,細(xì)胞學(xué)漏檢了25-29年齡段的大多數(shù) ≥CIN3病例,Percentages shown are for hrHPV+ women with ≥CIN3, N=252Huh W, et al. 27th International Papillomavirus Conference, Berlin, Germany, September

20、 17–22, 2011, OP-229.,比率≥CIN3 (%),年齡,,4. 宮頸病變術(shù)后的追蹤與管理,2013年ASCCP指南推薦的CIN2, 3 管理*,*如果妊娠或年齡在21–24 歲的女性，管理選擇可能會(huì)有所差異,術(shù)前、術(shù)后的檢測(cè)提示病灶是否清除干凈術(shù)后 6、12 個(gè)月復(fù)查HPV檢測(cè)，若結(jié)果仍為陽性，提示有殘留病灶或復(fù)發(fā)可能CIN 轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)，若 CIN 不伴HPV ，預(yù)示良性轉(zhuǎn)歸,5. HPV分型及定量檢測(cè)的臨床

21、應(yīng)用,預(yù)測(cè)病變的發(fā)展或轉(zhuǎn)歸對(duì)于非CIN的HPV檢測(cè)陽性患者，根據(jù)病毒型別及載量的變化，監(jiān)測(cè)患者HPV是自限性感染（一過性感染）或持續(xù)性感染，預(yù)測(cè)患者病變的發(fā)展或轉(zhuǎn)歸風(fēng)險(xiǎn)提示高病毒載量預(yù)示著患者自我消退的時(shí)間更長(zhǎng)以及潛在的病變風(fēng)險(xiǎn)更高，提示臨床需進(jìn)行更為積極的管理指導(dǎo)疫苗的使用和研究2006年FDA批準(zhǔn)了第一代四價(jià)抗HPV疫苗（抗HPV16、18、6、11），2014年FDA又批準(zhǔn)了9價(jià)抗HPV疫苗（抗HPV16、18

22、、31、33、45、52 、 58 、6、11），推薦對(duì)已有性生活的人群，在接種疫苗前進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè),Shen G, Chen J, Wang Y, et al, 2014. Jonas Lefevre,Catherine Hankins ,et al. 2004. 廖秦平, 趙健, 2010.,病毒載量是宮頸病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素,隨著HPV病毒載量的增加，細(xì)胞異常的比例顯著增加,Bigras G, Marval F D

23、. British Journal of Cancer, 2005, 93(5):575-81.,病毒載量越高，持續(xù)感染的時(shí)間越長(zhǎng),病毒載量可預(yù)測(cè)病毒的清除或疾病的進(jìn)展,Trevisan A, Schlecht N F, Ramanakumar A V, et al. Journal of General Virology, 2013, 94(Pt 8):1850-1857.,三種不同的檢測(cè)試劑，評(píng)估不同三個(gè)區(qū)隔每單位細(xì)胞內(nèi)HPV16型

24、拷貝數(shù)隨時(shí)間的清除情況,喬友林團(tuán)隊(duì)載量預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)的研究,,,結(jié)論：HR HPV病毒載量越高，發(fā)生宮頸癌及高度病變的風(fēng)險(xiǎn)越高，提高病毒載量界值可以進(jìn)一步分流HPV陽性人群，從而更合理的分配衛(wèi)生資源。,Kang L, Zhao F, Chen F, et al. [Value of high risk human papillomavirus viral load in predicting cervical lesions and tria

25、ging for high risk (HR)-HPV-positive women].[J]. Zhonghua zhong liu za zhi [Chinese journal of oncology], 2014, 36(4):316-20.,內(nèi)容,HPV檢測(cè)技術(shù)的誕生背景HPV檢測(cè)臨床應(yīng)用的進(jìn)展HPV檢測(cè)主要的技術(shù)及進(jìn)展碩世21HPV分型定量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),國(guó)內(nèi)主要HPV檢測(cè)產(chǎn)品,非核酸信號(hào)放大法,digene HC2 HP

26、V檢測(cè)：檢測(cè)13種高危型，不分型,德國(guó)凱杰,careHPV檢測(cè)：檢測(cè)14種高危型，不分型,DH2 ：檢測(cè)14種高危型，不分型 DH3 ：檢測(cè)16/18型+12高危型不分型,雜交捕獲法,酶切信號(hào)放大法,Cervista HR ：檢測(cè)14種高危型，分組但不分型 Cervista 16/18 ：檢測(cè)16&18分型,DNA裂解成為單鏈,HC2全長(zhǎng)8000堿基對(duì)的RNA探針與DNA雜交,一抗捕獲固定DNA:RNA雜交體,酶催化底物化學(xué)

27、發(fā)光，基因信號(hào)放大儀器檢測(cè)發(fā)光信號(hào),HC2（Hybrid Capture 2）雜交捕獲二代技術(shù),攜帶堿性磷酸酶的二抗與固定的雜交體結(jié)合,利用基因雜交、化學(xué)發(fā)光、信號(hào)放大的原理，13種高危型HPV（不分型，半定量）,核酸信號(hào)放大法,Aptima HR &Aptima 16、18/45,15高危分型,15高危不分型,16/18分型+13不分型,凱普的21HPV分型檢測(cè)（PCR+膜雜交法，定性檢測(cè)）,cobas x 480全自動(dòng)核酸分

28、離純化儀,cobas z 480聚合酶鏈反應(yīng)儀,日常維護(hù)2-7分鐘（手工）,樣本制備62-149分鐘,轉(zhuǎn)換到z4802-3分鐘（手工）,DNA擴(kuò)增和檢測(cè)86-120分鐘,卸載z480中的反應(yīng)板1分鐘（手工）,樣品加載到x48011-27分鐘（手工）,,檢測(cè)96樣本約需5小時(shí)，其中手工用時(shí)需約40分鐘,基于LightCycle480實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)四個(gè)熒光信號(hào)檢測(cè)通道，分別檢測(cè)：內(nèi)質(zhì)控（Intern control）、HP

29、V16型、HPV18型和12高危型HPV,采用磁珠分離技術(shù)分離核酸原始收集管可直接上樣，但樣本加載需要人工操作，特別是加載液基細(xì)胞學(xué)樣本時(shí)需要手工開蓋所用耗材（槍頭、微孔板等）必須額外購(gòu)買cobas4800專用耗材,cobas4800 檢測(cè)原理及流程,cobas HPV檢測(cè),1次檢測(cè)可在4個(gè)通道內(nèi)分別報(bào)告HPV16型，HPV18型，其他12種高?；旌闲图皟?nèi)質(zhì)控β-globin的結(jié)果,Wright TC Jr, et al. Am J

30、 Obstet Gynecol 2012; 206:46.e1-.e11,1、磁珠提取mRNA,2、TMA，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增,3、雜交保護(hù)及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)（DKA）,T(胸腺嘧啶）構(gòu)成的核苷酸鏈固定于磁珠上,寡核苷酸序列捕獲目標(biāo)RNA,APTIMA HPV檢測(cè)（TMA技術(shù)，定性檢測(cè)）,精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)：HPV檢測(cè)的應(yīng)用進(jìn)展,雜交捕獲技術(shù)檢測(cè)13 種高危HPV不分型半定量,熒光PCR技術(shù)檢測(cè)14種高危HPV16/18分型定性,轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增

31、 （TMA）檢測(cè)14種高危HPV16,18/45分型定性,熒光PCR技術(shù)檢測(cè)18種高中危+3種低危型21種HPV分型 &標(biāo)準(zhǔn)化定量,不分型»分型 & 定性»定量,內(nèi)容,HPV檢測(cè)技術(shù)的誕生背景HPV檢測(cè)臨床應(yīng)用的進(jìn)展HPV檢測(cè)主要的技術(shù)及進(jìn)展碩世21HPV分型定量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),碩世21HPV分型定量檢測(cè)系統(tǒng)簡(jiǎn)介,采用獨(dú)有專利的“宮頸脫落細(xì)胞取樣處理標(biāo)準(zhǔn)化”技術(shù)和先進(jìn)的多重?zé)晒釶CR

32、定量技術(shù)，可在2.5小時(shí)內(nèi)快速、準(zhǔn)確地區(qū)分樣本中的21種HPV亞型，包括13種高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，5種中危型HPV26、53、66、73、82和3種低危型HPV6、11、81；并同步對(duì)21種HPV各亞型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量。,創(chuàng)新與突破1：分管分型,定量參考基因檢測(cè),分管區(qū)分21種HPV基因亞型,中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京院研究數(shù)據(jù),,碩世HPV檢測(cè)與型別鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法比較，

33、準(zhǔn)確性99.6%,碩世HPV檢測(cè)（BMRT）的篩查性能：北京大學(xué)深圳醫(yī)院臨床研究數(shù)據(jù),Chen Q, Du H, Zhang R, et al. Genetics and molecular research: GMR, 2016, 15(2).,自采樣的檢測(cè)，碩世21HPV分型定量檢測(cè)（BMRT）敏感性高于cobas HPV檢測(cè),,,,,全面檢測(cè)CFDA要求檢測(cè)的18種高危型,2015年CFDA頒布最新HPV試劑指導(dǎo)原則,http:/

34、/www.sfda.gov.cn/WS01/CL0087/136485.html,原文：依據(jù)WHO國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）及其他國(guó)際組織的研究成果，本指導(dǎo)原則建議將HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種基因型列為高危型別，26、53、66、73、82等5種基因型列為中等風(fēng)險(xiǎn)型別。,兩種方法HPV檢測(cè)型別的比較,碩世21HPV分型定量檢測(cè)18高中危型與CFDA最新要求完全一致,,準(zhǔn)確

35、區(qū)分中國(guó)人群常見致病型別,*全球HPV信息中心（ICO）最新發(fā)布，鏈接網(wǎng)址：http://www.hpvcentre.net/index.php,WHO/ICO HPV相關(guān)統(tǒng)計(jì): 宮頸癌前病變排名前10位HPV型別的分布*,,,北京大學(xué)深圳醫(yī)院臨床數(shù)據(jù),研究檢出頻率位于前四位的亞型是HPV 16、52、58、33,*研究選用的HPV檢測(cè)方法為：碩世21HPV分型定量檢測(cè),Prof. Wu ’s Data,準(zhǔn)確分型，風(fēng)險(xiǎn)分層,2%,0%

36、,,癌前病變風(fēng)險(xiǎn),,陰道鏡閾值,10%,30%,Nicolas Wentzensen， 2015,創(chuàng)新與突破2：標(biāo)準(zhǔn)化定量,宮頸脫落細(xì)胞,HPV病毒,,,專利號(hào)：ZL 201110087602.1,碩世21HPV分型定量檢測(cè)是首個(gè)、唯一采用標(biāo)準(zhǔn)化定量的HPV分型檢測(cè),中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京院研究數(shù)據(jù),313例HPV16陽性病例，隨著病變等級(jí)提高載量也相應(yīng)增加,Sun Z et al. Bmc Cancer, 2015.,北京大學(xué)深圳醫(yī)院臨

37、床驗(yàn)證數(shù)據(jù),碩世21HPV分型定量檢測(cè)：不同程度宮頸病變病灶中HPV亞型病毒載量,,HPV 16,HPV 52,HPV 58,Prof. Wu ‘s Data,北京大學(xué)深圳醫(yī)院臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù),碩世21HPV分型定量檢測(cè)：不同程度病變病灶組織中病毒載量,Prof. Wu ‘s Data,碩世21HPV分型定量報(bào)告單,,,HPV風(fēng)險(xiǎn)分層列表,,HPV陽性亞型,,每10000個(gè)細(xì)胞數(shù)量中的病毒載量，對(duì)應(yīng)顯示為：6.82×107拷貝