應用焦磷酸測序技術行HPV分型檢測及HPV16甲基化狀態(tài)與宮頸致癌作用研究.pdf

1、一、焦磷酸測序技術行宮頸脫落細胞Hr-HPV（高危型HPV）分型檢測
　　 目的：評價焦磷酸測序技術在Hr-HPV分型檢測中的應用價值，分析此方法的準確性、檢出高級別宮頸病變的有效性，及應用于臨床檢查和大規(guī)模篩查的可行性。同時獲取以陰道鏡門診患者為研究人群的Hr-HPV感染比例及所感染病毒型別的分布。
　　 內容：以200名陰道鏡門診患者為研究對象，所有患者均接受宮頸液基細胞學檢查（TCT）、HC-Ⅱ檢測、焦磷酸測序Hr

2、-HPV分型檢查。評估焦磷酸測序技術在宮頸Hr-HPV檢測中的應用價值；分析焦磷酸測序Hr-HPV檢查結果與HC-Ⅱ檢測的一致性；評價焦磷酸測序技術檢出宮頸高級別病變（CINⅡ及以上病變）的價值；分析研究人群中Hr-HPV型別分布。
　　 方法：應用焦磷酸測序法檢測12型Hr-HPV（包括HPV16，18，31,33，35，39，45，51，52，56，58和59）感染。自宮頸液基細胞學檢查剩余細胞中提取DNA，經HPV通用型引

3、物擴增后，行焦磷酸測序檢測以上12型Hr-HPV，其中每四種型別測序引物至于同一反應池中，僅需10分鐘即可完成測序反應。分析此種檢測技術與美國FDA唯一認證的HPV臨床檢測手段-HC-Ⅱ方法檢測出Hr-HPV感染的一致性；評價其作為宮頸癌及宮頸癌前病變篩查手段的有效性；根據測序結果確定標本中特異型別的Hr-HPV感染，了解研究人群中Hr-HPV感染的型別分布。并將通用型引物PCR陽性而焦磷酸測序陰性標本的PCR產物純化、克隆后行傳統(tǒng)測序

4、分型檢測，確定所感染的HPV型別。
　　 結果：經焦磷酸測序檢測，發(fā)現200例研究對象中Hr-HPV感染98例，其中單一感染88例，雙重感染10例，檢測出9種Hr-HPV感染（HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV39，HPV45，HPV52，HPV58和HPV59）。Hr-HPV感染中，HPV16感染率為69.4％，占第一位；HPV-58感染率為16.3％，占第二位。焦磷酸測序檢測出的Hr-HPV感染率與宮頸病

5、變呈正相關關系（Kendall值為0.704，P<0.001）；此方法檢出高級別宮頸疾患的敏感性和特異性分別為95％和65.1％，ROC曲線下面積為0.80；焦磷酸測序檢測Hr-HPV與HC-Ⅱ方法有高度的一致性（Kappa值為0.791，P<0.001）。
　　 結論：焦磷酸測序檢測技術應用于Hr-HPV檢測與HC-Ⅱ方法有很好地一致性，并可以進行HPV分型檢測。其對宮頸CINⅡ及以上病變具有很好的檢出率。是宮頸癌及癌前病變篩

6、查的有效手段。
　　 二、應用焦磷酸測序技術對HPV16 L1片段3’端和LCR上CpG位點甲基化水平行定位、定量檢測并分析與HPV16致宮頸癌作用相關性
　　 目的：應用焦磷酸測序技術定位、定量檢測位于HPV16 L1片段3’端和LCR上的21個甲基化位點的甲基化率，分析比較無宮頸病變攜帶者、CIN患者和宮頸癌患者間各甲基化位點甲基化率差異，了解HPV16甲基化與其致病性的關系。
　　 內容：以HPV16陽性的

7、無宮頸病變病毒攜帶者、CIN患者和宮頸癌患者各30例為研究對象，研究各組患者所感染HPV16病毒L1片段3’端和LCR片段甲基化位點的甲基化狀念，分析評價HPV16甲基化與其致病性間關系。
　　 方法：選擇HPV16陽性的無宮頸病變病毒攜帶者、CIN患者和宮頸癌患者各30例，使用宮頸液基細胞學檢查剩余細胞提取DNA，經重亞硫酸鹽處理后，分7個片段擴增HPV16 L1片段3’端和LCR區(qū)域（此區(qū)域包含E6/E7啟動子增強子及E2結

8、合位點），應用焦磷酸檢測技術經測序分析檢測研究片段所涉及的21個CpG位點甲基化狀態(tài)，比較每一個甲基化位點甲基化率在三組患者間是否存在差異，評價HPV16甲基化與其致病性間的關系。
　　 結果：經定位、定量檢測HPV16目的片段上21個CpG位點甲基化水平，發(fā)現位于E6/E7啟動子的5個甲基化位點均存在隨病情進展甲基化率逐漸減低趨勢，在無宮頸病變病毒攜帶者、CIN患者和宮頸癌患者三組間存在顯著性差異。位于L1片段3’端7032，

9、7019，7136三個位點的甲基化率在三組間存在顯著性差異，7032和7019位點無病變攜帶者甲基化率最低，宮頸癌者甲基化率最高，7136位點CIN組甲基化率最高，宮頸癌組次之，無病變者最低。
　　 結論：HPV16 L1片段3’端及E6/E7啟動子CpG位點甲基化率在三組患者中存在顯著性差異，這種甲基化差異可促進HPV16與宿主基因整合、E6/E7癌基因表達從而導致宮頸癌的發(fā)生。HPV16甲基化狀況可能成為鑒別HPV16自愈性