異丙酚對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞色素C釋放的影響.pdf

1、目的：用原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞，制造缺血再灌注凋亡模型，觀察異丙酚對凋亡過程中不同時(shí)間點(diǎn)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C釋放含量變化的影響，探討異丙酚在神經(jīng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程中的保護(hù)作用機(jī)制。 方法： 1.孕18天大鼠胎鼠，分離海馬，切碎后經(jīng)0.125％(1.25g/L)胰蛋白酶消化得到細(xì)胞懸液，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，進(jìn)行海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)。相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。 2.采用低糖無氧培養(yǎng)即營養(yǎng)剝奪模型

2、，獲得腦缺血缺氧凋亡模型。將培養(yǎng)細(xì)胞更換含10％胎牛血清的低糖DMEM/F12培養(yǎng)液，置入缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時(shí)，再更換為原含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，復(fù)氧培養(yǎng)24小時(shí)。 3.分組及給藥方法：將培養(yǎng)7～9天的胎鼠海馬細(xì)胞預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)保證各瓶細(xì)胞數(shù)量達(dá)5*10<'8>cells/L。三瓶一組，隨機(jī)分為正常對照組(C組)--正常培養(yǎng)，不施加缺血缺氧培養(yǎng)；模型組(M組)--缺血缺氧及復(fù)氧過程中不加異丙酚；異丙酚Ⅰ組，于

3、缺氧前向培養(yǎng)液中加入先前配置的異丙酚溶液至培養(yǎng)液中異丙酚終濃度為200μM和20μM(Ⅰ<,1>和Ⅰ<,2>)；異丙酚Ⅱ組于缺氧6h后復(fù)氧開始前以同樣方法加入異丙酚溶液至培養(yǎng)液中異丙酚終濃度分別為200μM和20μM(Ⅱ<,1>和Ⅱ<,2>)。異丙酚Ⅲ組于復(fù)氧后2h加入異丙酚溶液至培養(yǎng)液中異丙酚終濃度為200μM。 4.分別對各組取缺氧前(T<,0>)、缺氧完畢(T<,1>)、復(fù)氧2小時(shí)(T<,2>)、復(fù)氧24小時(shí)(T<,3>)

4、樣本，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，測定胞漿內(nèi)所含細(xì)胞色素C的濃度。 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 1.光鏡觀察：正常對照組(C組)神經(jīng)元在常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，神經(jīng)元形態(tài)及存活數(shù)無明顯變化；模型組(M組)缺氧6小時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)改變，部分神經(jīng)元胞體腫脹增大；復(fù)氧兩小時(shí)，細(xì)胞較多出現(xiàn)凋亡期形態(tài)變化，胞膜對稱性喪失、染色質(zhì)凝集、細(xì)胞皺縮，凋亡小體形成

5、；至復(fù)氧24小時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，存活細(xì)胞數(shù)量少；異丙酚各組同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)較模型組(M組)有明顯改善，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少。大劑量組差異更明顯。Ⅰ<,1>組甚至與正常對照組，(C組)相近。。各異丙酚組間24小時(shí)(T<,3>)點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)及存活數(shù)量差異不明顯。 2.胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C濃度變化： 1)正常對照組(C組)：神經(jīng)元胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C在T<,1>及T<,2>時(shí)間點(diǎn)較T<,0>點(diǎn)無明顯增加，T<

6、,3>點(diǎn)測定值較T<,0>點(diǎn)有增加趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)； 2)模型組(M組)：與缺氧前(T<,0>)對比，模型組(M組)缺氧結(jié)束(T<,1>)和復(fù)氧2小時(shí)(T<,2>)細(xì)胞色素C均有增高(P<0.05)，且T<,2>較T<,1>時(shí)間點(diǎn)持續(xù)增高(P<0.05)。M組T<,1>、T<,2>、T<,3>時(shí)間點(diǎn)與C組間比較細(xì)胞色素C濃度皆有增加，且差異顯著(P<0.05)； 3)異丙酚組：與對照組(C組)比較，缺

7、氧完畢(T<,1>)、復(fù)氧2小時(shí)(T<,2>)時(shí)間點(diǎn)Ⅰ<,2>、Ⅱ<,1>、Ⅱ<,2>、Ⅲ組也有細(xì)胞色素C濃度升高，且差異顯著(P<0.05)，Ⅰ<,1>組與C組T<,2>點(diǎn)無顯著性差別(P>0.05)；24小時(shí)(T<,3>)點(diǎn)各異丙酚組與正常對照組(C組)比較則無顯著差異(P>0.05)； 4)異丙酚各組濃度與模型組(M組)比較：缺氧完畢(T<,1>)、復(fù)氧2小時(shí)(T<,2>)、復(fù)氧24小時(shí)(T<,3>)時(shí)間點(diǎn)皆有顯著降低，L

8、SD檢驗(yàn)顯示有顯著性差異(P<0.05)； 5)各異丙酚組：與基礎(chǔ)測定值對比，缺氧完畢(T<,1>)、復(fù)氧2小時(shí)(T<,2>)、復(fù)氧24小時(shí)(T<,3>)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞色素C濃度呈增加趨勢。 6)異丙酚組組間比較：異丙酚Ⅰ組在缺氧完畢(T<,1>)、復(fù)氧2小時(shí)(T<,2>)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞色素C值低于異丙酚Ⅱ、Ⅲ組，差異顯著(P<0.05)。24小時(shí)(T<,3>)點(diǎn)各組則無顯著差異(P>0.05)。異丙酚Ⅲ組與Ⅱ1組對比，復(fù)氧2

9、小時(shí)(T<,2>)差異顯著(P<0.05)，復(fù)氧24小時(shí)(T<,3>)無顯著差異(P>0.05)；與Ⅱ<,2>組對比，復(fù)氧2小時(shí)(T<,2>)、復(fù)氧24小時(shí)(T<,3>)時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(P>0.05)。 7)不同劑量異丙酚組對比：大劑量(Ⅰ<,1>、Ⅱ<,1>)組在復(fù)氧2小時(shí)(T<,2>)時(shí)間點(diǎn)與小劑量組(Ⅰ<,2>、Ⅱ<,2>)比較差異顯著(P<0.05)，LSD檢驗(yàn)顯示大劑量(Ⅰ<,1>、Ⅱ<,1>)組胞漿細(xì)胞色素C值低于