噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌技術(shù)的引進(jìn)與運(yùn)用-自貢市疾病預(yù)防

1、核酸指紋圖譜分析應(yīng)用于分枝桿菌菌種鑒定,自貢市疾病預(yù)防控制中心 鄧建平 2017.04,前言,分枝桿菌屬包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC,包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、卡介苗)、麻風(fēng)分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria，NTM)。自1882年Koch發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌以來，已報(bào)道了100余種分枝桿菌，其中約30種與人類或動(dòng)物疾病有關(guān)。其中結(jié)核分枝桿

2、菌(MTB)是最常見且是最重要的致病菌。不同分枝桿菌感染的癥狀、體征及影像學(xué)檢查并無特異性，而各自的治療方案卻差異較大。為對(duì)結(jié)核病病原做出準(zhǔn)確判定，以及在亞種水平上對(duì)我市分枝桿菌臨床分離株復(fù)合群進(jìn)行菌種鑒定，是結(jié)核病防治工作中，病原學(xué)診斷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。,一、結(jié)核病的流行疫情,結(jié)核病是伴隨人類歷史最長(zhǎng)，由單一致病菌造成人類死亡最多的慢性傳染病，歷史上稱其為“白色瘟疫”，我國(guó)舊稱“癆病”，民間素有“十癆九死”的之說。在20世紀(jì)40年代鏈霉

3、素等抗結(jié)核藥物發(fā)明之前，結(jié)核病幾乎是不治之癥。 根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),全球結(jié)核病感染人數(shù)約20億,每年新發(fā)病例800萬,每年死于結(jié)核的人數(shù)約130萬。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，患者人數(shù)僅次于印度、印尼，居全球第三位。,3,,WHO發(fā)布2016年全球結(jié)核病報(bào)告,2016年10月14日 發(fā)布，數(shù)據(jù)涵蓋了202個(gè)國(guó)家和地區(qū)的99%的人口和結(jié)核病病例。 2015年，世界范圍內(nèi)估計(jì)有1040萬新發(fā)病例，其中

4、男性590萬（56%），女性350萬（34%），兒童100萬（34%）。新發(fā)病例中有120萬（11%）HIV患者。 印度、印度尼西亞、中國(guó)、尼日利亞、巴基斯坦和南非這六個(gè)國(guó)家占了新發(fā)病例總數(shù)的60%。 2015年全球估計(jì)有48萬新發(fā)的MDR-TB病例和10萬耐利福平結(jié)核?。≧R-TB）病例。印度、中國(guó)和俄羅斯三個(gè)國(guó)家占所有這58萬病例的45%。 2015年有140萬人死于結(jié)核病，另外40萬

5、是TB/HIV雙重感染人群死亡。雖然在2000到2015年間，結(jié)核病死亡以22%的速度在下降，但2015年結(jié)核病仍然排在全部死亡原因中的前十名。,WHO發(fā)布2016年全球結(jié)核病報(bào)告,全球在2000到2015年避免了4900萬結(jié)核病死亡。2015年全球報(bào)告肺結(jié)核病例610萬，仍有約430萬的估算病例未被發(fā)現(xiàn)和報(bào)告。在2015年估計(jì)的58萬MDR-TB患者中，只有12.5萬（20%）得到了治療。2013年MDR-TB病例隊(duì)列的治療成功率

6、為52%。2015年，55%的報(bào)告肺結(jié)核病例進(jìn)行了HIV檢測(cè)，TB/HIV 雙重感染的病例中接受抗病毒治療的占78%。,結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家前三位,每年報(bào)告發(fā)病數(shù)仍居甲乙類傳染病的第二位西部地區(qū)疫情重主要以農(nóng)牧民為主老年人高發(fā),,我國(guó)仍是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一2014年新發(fā)結(jié)核病患者93萬，位居全球第3位占全球患者數(shù)的9.7%,我國(guó)結(jié)核病疫情現(xiàn)狀,我國(guó)結(jié)核病疫情現(xiàn)狀,“六多”的特點(diǎn) ：1、感染人數(shù)多。目前全國(guó)約有5．5億人感

7、染過結(jié)核菌，感染率達(dá)到44．5％，高于全球1／3的感染率水平。2、患病人數(shù)多。全國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核病人約450萬，患病人數(shù)居世界第二位。3、新發(fā)患者多。全國(guó)每年新發(fā)生肺結(jié)核患者約145萬。2004年，全國(guó)法定報(bào)告的甲、乙類傳染病中，肺結(jié)核的報(bào)告發(fā)病率位居首位。4、死亡人數(shù)多。全國(guó)每年約有13萬人死于結(jié)核病，是各種其他傳染病和寄生蟲病死亡人數(shù)總和的2倍。5、農(nóng)村患者多。全國(guó)約有80％的結(jié)核病患者集中在農(nóng)村，而且主要在中西部地區(qū)。

8、6、耐藥患者多。全國(guó)菌陽(yáng)肺結(jié)核病人中耐藥病人約占1／4，而據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，全球每年新發(fā)生的耐藥結(jié)核病人中，有1／4在我國(guó)。一名涂陽(yáng)肺結(jié)核患者若不加以治療，一年平均可感染10-15名易感者。,二 非結(jié)核分枝桿菌概況,非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM) ： 指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群( 包括結(jié)核、牛、非洲和田鼠分枝桿菌) 和麻風(fēng)分枝桿菌以外的一大類分枝桿菌的總稱。非結(jié)核分支桿菌感染 ： 感

9、染了NTM, 但未發(fā)病。非結(jié)核分支桿菌病 ： 感染了NTM, 并引起相關(guān)組織、臟器的病變。,非結(jié)核分枝桿菌分離,全國(guó) 27 省全人群 NTM 感染率,感染率特點(diǎn)–?省間差異從1.9%～ 44.9%–?地理特征南方高于北方，沿海高于內(nèi)地–?氣溫溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū),分枝桿菌菌種鑒定的必要性,1.NTM病呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，已成為威脅人類健康的重要問題，1990：4.1% 2000：11.9% 2010：22.9%2.老年化現(xiàn)象：3

10、.診斷：影像學(xué)缺乏特異性、臨床癥狀不典型、可長(zhǎng)期誤診為結(jié)核病4.治療：對(duì)常用的抗結(jié)核藥物天然耐藥治療效果不確切、治療費(fèi)用較高及易引起不良反應(yīng),分枝桿菌菌種鑒定的現(xiàn)狀,目前診斷NTM的技術(shù)還十分滯后，最突出的是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制較差，不同的鑒定方法可能產(chǎn)生不同的鑒定結(jié)果，導(dǎo)致分枝桿菌假陽(yáng)性和假陰性升高。實(shí)驗(yàn)室菌種鑒定水平不高，使得1/4的NTM病誤診為結(jié)核病。因此，在條件允許的情況下，對(duì)已明確的NTM菌株進(jìn)行鑒定很重要，這有助于區(qū)分是否致病

11、菌，以進(jìn)一步指導(dǎo)臨床處理。,分枝桿菌鑒定方法,基于生長(zhǎng)特性和生化反應(yīng)的傳統(tǒng)方法基于特定基因序列的分子分型方法(如核酸指紋圖譜分析,hsp65,rpoB基因多態(tài)性)根據(jù)菌體特定成份(如脂肪酸,分枝菌酸等)建立的色譜法 基于蛋白組學(xué)的飛行質(zhì)譜技術(shù),三 核酸指紋圖譜法,核酸指紋圖譜分析是以分枝桿菌復(fù)合群各菌種的特異性基因片段（16SrRNA、Rv0577、IS1561’、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8、Rv3120，代號(hào)

12、為1、2、3、4、5、6、7）作為靶標(biāo)，通過特異性基因片段的有無進(jìn)行菌種鑒定。針對(duì)上述7個(gè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異基因，合成7對(duì)特異引物7，分別對(duì)分枝桿菌的7個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增靶基因序列，產(chǎn)物電泳后獲得酶切指紋圖譜。,PCR定義,PCR反應(yīng)特點(diǎn),PCR反應(yīng)基本步驟,PCR技術(shù)的基本原理,,,,,,,,,,,,,核酸指紋圖譜操作步驟,1、DNA的提取,（1）水煮法,（2）CTAB提取法,（3）柱子提取法,（4）全自動(dòng)核酸提取法,水煮法提取DN

13、A,（1）收集菌體，用生理鹽水洗脫L-J培養(yǎng)基菌體；（2）離心收集菌體，400ul TE重新懸菌；（3）恒溫金屬浴98℃ 20分鐘，超聲波破碎 15分鐘；（4）13000rpm離心5分鐘；（5）取上清即為模板DNA。,全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA,2、PCR擴(kuò)增,在25ul反應(yīng)體系中，上、下引物各1ul,2×Taq PCR MasterMix 13ul，DNA模板4ul，純水6ul。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性9

14、4℃5min ，變性94℃ 1min ， 退火60℃1mi n，延伸72℃1 min ，循環(huán)次數(shù)30次，最后充分延伸72℃10 min， 每次擴(kuò)增分別設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照 。,3、電泳產(chǎn)物分析,擴(kuò)增產(chǎn)物 ，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果獲得核酸指紋圖譜 。,標(biāo)準(zhǔn)分枝桿菌核酸指紋圖譜,自貢市分枝桿菌指紋圖譜,自貢市分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果,2012至2016年共完成3650株菌株DNA提取及鑒定工作，以核酸為模板擴(kuò)增7個(gè)位點(diǎn)（16S rR

15、NA，Rv0577，IS1561’，Rv1510，Rv1970，Rv3877/8和Rv3120）的目的片段，根據(jù)核酸指紋圖譜初步鑒定結(jié)核分枝桿菌1634株、非洲Ⅰ型20株、非結(jié)核分枝桿菌38株。,該技術(shù)的引進(jìn)與應(yīng)用對(duì)了解我市結(jié)核分枝桿菌流行株的種型特征，進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查和研究，臨床診斷和治療提供了病原學(xué)依據(jù)，并取得可喜的成果。 使患者個(gè)體及時(shí)得到診治提供了保障，為控制結(jié)核病的傳播具有實(shí)際意義，同時(shí)推動(dòng)了中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的建設(shè)