滾環(huán)擴增技術檢測結核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB單堿基突變的應用研究.pdf

1、第一部分、HRCA技術檢測結核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變
　　目的:建立一種快速準確、經(jīng)濟簡便的檢測結核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變的支鏈滾環(huán)擴增(hyper-branched rolling circleamplification，HRCA)技術。
　　方法:
　　1.通過查閱文獻并進行臨床調(diào)查，確立結核分枝桿菌rpoB基因531位點絲氨酸突變(C-T)的檢測目標。根據(jù)結核分枝桿菌標準菌株H37Rv的rpoB基

2、因標準序列信息（從NCBI中獲得），設計檢測該基因突變位點的鎖式探針以及用于臨床標本耐藥基因rpoB基因的PCR擴增引物。
　　2.建立并優(yōu)化檢測結核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變的支鏈滾環(huán)擴增技術，包括:鎖式探針與模板連接環(huán)化溫度，連接環(huán)化時間;滾環(huán)擴增最適溫度、擴增時間。
　　3.通過對人工合成的野生型靶序列、突變型靶序列、其他非相關基因序列以及不加靶序列的反應體系進行檢測，討論該方法的特異性和靈敏度。
　　4.采

3、用支鏈滾環(huán)擴增技術對臨床標本進行檢測，驗證該檢測技術的臨床應用價值。
　　結果:
　　1.鎖式探針與相應模板65℃連接1h可保證檢測的特異性。37℃滾環(huán)擴增1h，能夠得到明顯的擴增結果，且通過對不同濃度突變型靶序列樣本的檢測，采用該技術最低能檢測出樣本中含有1％的突變株。
　　2.利用支鏈滾環(huán)擴增技術分別檢測了臨床結核桿菌利福平耐藥株、利福平敏感株以及結核分枝桿菌標準株H37Rv。檢測結果與測序結果一致。
　　結

4、論:我們建立的用于檢測結核分枝桿菌rpoB基因突變的支鏈滾環(huán)擴增技術，具有特異性高、靈敏度高、簡單易操作的優(yōu)點。本檢測方法與傳統(tǒng)方法相比，大大縮短了檢測時間，而且不需特殊儀器和試劑，大大降低了檢測成本。
　　第二部分、滾環(huán)擴增技術聯(lián)合DNA芯片檢測結核分枝桿菌rpoB基因突變
　　目的:將滾環(huán)擴增技術與DNA芯片技術相結合，建立一種檢測結核分枝桿菌rpoB基因突變的芯片技術。
　　方法:
　　1.以結核分枝桿菌r

5、poB基因為研究對象，選擇531位點的絲氨酸突變(C-T)作為檢測目標，根據(jù)鎖式探針與模板結合區(qū)外的序列設計通用寡核苷酸探針，作為捕獲探針，用于包被醛基玻片。
　　2.通過檢測人工合成的野生型和突變型靶序列，證明所設計寡核苷酸探針的準確性及本檢測方法的可靠性，并優(yōu)化該方法的反應條件，同時討論其特異性和靈敏度。
　　3.利用本方法對臨床樣本進行檢測，并將檢測結果與樣本測序結果比對，從而驗證本方法的準確性及臨床應用價值。

6、　　結果:
　　1.將設計好的捕獲探針點于醛基片上預先設計好的點樣點，對人工合成靶序列進行檢測。相應突變型位點和陽性對照位點均有明顯顯影結果，背景清晰，陰性對照位點及其他點樣點均無顯影結果。證明設計的探針合理可靠，本檢測方法特異性好且準確可靠。
　　2.通過對不同濃度突變型靶序列樣本的檢測，研究發(fā)現(xiàn)該方法最低可檢測出含有5fmol/L突變型靶序列的樣本。
　　3.采用本方法對臨床樣本進行檢測，結果顯示，陽性對照與突變型