結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥性的噬菌體檢測(cè)技術(shù)與耐藥基因突變研究.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的一種慢性傳染性疾病，是現(xiàn)在世界上最普遍和最嚴(yán)重的人類(lèi)傳染病之一，也是全世界由單一致病菌致死最多的疾病之一。由于耐藥性結(jié)核桿菌的出現(xiàn)與傳播、艾滋病的流行以及人口的頻繁流動(dòng)等原因，結(jié)核病疫情呈現(xiàn)全球性的回升。吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)是治療結(jié)核病最有效的一線(xiàn)藥物之一，快速準(zhǔn)確的PZA耐藥性檢測(cè)技術(shù)對(duì)臨床治療及

2、控制結(jié)核病具有重要的意義。吡嗪酰胺耐藥的精確的分子機(jī)理還未被闡明，對(duì)吡嗪酰胺耐藥相關(guān)基因pncA的突變進(jìn)行研究有很大的理論及應(yīng)用參考意義。 [目的]本研究旨在建立起結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥性的噬菌體生物擴(kuò)增(PhageAmplofiedBiologicallyAssay，PhaB)快速檢測(cè)方法，并探討和評(píng)價(jià)所建方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥菌株的PZA耐藥相關(guān)基因pncA的突變進(jìn)行研究，對(duì)PZA耐藥機(jī)制進(jìn)行初步

3、探索，為以后進(jìn)行PZA耐藥機(jī)制研究提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 [方法]應(yīng)用PhaB法，對(duì)液體培養(yǎng)基的pH值、PZA藥物濃度、藥物作用時(shí)間進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，通過(guò)正交法篩選和優(yōu)化檢測(cè)條件，并對(duì)不同的噬菌體侵染環(huán)境的恢復(fù)方法進(jìn)行比較來(lái)確定最佳恢復(fù)方法；應(yīng)用所建方法對(duì)109株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行PZA耐藥性的測(cè)定，并將檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)藥敏檢測(cè)方法結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果不相符的菌株進(jìn)行最低抑菌濃度(minimuminhibitoryc

4、oncentration，MIC)測(cè)定，以探討和評(píng)價(jià)所建方法的應(yīng)用價(jià)值；將結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥株的耐藥相關(guān)基因pncA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后對(duì)全基因進(jìn)行測(cè)序，對(duì)pncA基因突變進(jìn)行研究。 [結(jié)果]PhaB法檢測(cè)PZA耐藥性的最佳條件為液體培養(yǎng)基pH值為5.5、PZA藥物濃度200ug/ml、37℃作用48小時(shí)，確定離心洗滌為噬菌體侵染環(huán)境的恢復(fù)方法。對(duì)109株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行PZA耐藥性測(cè)定，常規(guī)絕對(duì)濃度藥敏法檢測(cè)結(jié)果為敏

5、感35株，耐藥74株；PhaB法檢測(cè)結(jié)果為敏感34株，耐藥75株，與絕對(duì)濃度法檢測(cè)結(jié)果的符合率為91.7％，對(duì)兩種檢測(cè)方法不相符的9株菌株進(jìn)行MIC測(cè)定，結(jié)果6株(3株敏感，3株耐藥)與PhaB法相符合，如以絕對(duì)濃度法測(cè)定PZA耐藥性結(jié)果為考核標(biāo)準(zhǔn)，則PhaB法檢測(cè)PZA耐藥性的敏感性為94.6％(70/74)、特異性為85.7％(30/35)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.3％(70/75)、陰性預(yù)測(cè)值為88.2％(30/34)、準(zhǔn)確性為91.7

6、％(100/109)。與常規(guī)藥敏方法耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)6-8周相比，PhaB法檢測(cè)PZA耐藥性?xún)H需2-3天，但與常規(guī)藥敏方法符合率高且實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好。對(duì)47株P(guān)ZA耐藥菌株進(jìn)行pncA基因測(cè)序，結(jié)果19株的pncA基因存在各種不同形式的突變，突變率達(dá)40.43％，在所有突變形式中，除已經(jīng)見(jiàn)報(bào)道的突變形式外，我們還發(fā)現(xiàn)了22個(gè)新的突變位點(diǎn)，這22種新的突變位點(diǎn)形成12種新的突變形式。 [結(jié)論]PhaB法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥性具有快速

7、、操作簡(jiǎn)便、與常規(guī)藥敏方法符合率較高等特點(diǎn)，且不需要特殊儀器設(shè)備，所用試劑也是一般常規(guī)試劑且價(jià)格低廉，可以作為PZA耐藥性快速檢測(cè)的篩選方法。所以本法具有重要的臨床檢測(cè)應(yīng)用和推廣價(jià)值，特別適合于像我國(guó)這樣的結(jié)核病耐藥率高的發(fā)展中國(guó)家和經(jīng)濟(jì)落后的貧困國(guó)家和地區(qū)推廣應(yīng)用。 本研究也證明，PZA耐藥相關(guān)基因pncA的突變是結(jié)核分枝桿菌對(duì)PZA產(chǎn)生耐藥的主要原因，更為重要的是我們發(fā)現(xiàn)了22種新的突變位點(diǎn)，這22種新的突變形成12種新的p