夏建川生物治療及在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用

1、腫瘤生物治療及在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用,中山大學(xué)腫瘤防治中心夏建川,腫瘤生物治療的概念,腫瘤生物治療主要通過機(jī)體的免疫機(jī)制或生物制劑的作用以調(diào)節(jié)機(jī)體自身的生物學(xué)反應(yīng), 從而達(dá)到治療腫瘤的目的。它主要包括腫瘤的基因治療、免疫治療和免疫基因治療。近年來，生物分子靶向藥物也納入生物治療的范疇。隨著分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤的生物治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種腫瘤治療模式，在臨床上已顯示出良好的應(yīng)用前景。,一、基因治療,基

2、因治療（gene therapy）——應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù)向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能基因，以糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。對象： 體細(xì)胞 生殖細(xì)胞,基因治療被認(rèn)為是多種重要疾病包括腫瘤治療的希望所在,1990 Ashanti de Silva，USA 1999 Jesse Gelsinger，USA 2000 Alain Fischer，F(xiàn)rance 2003 Adrian Thras

3、her，UK,Jesse Gelsinger，1999,Ashanti de Silva，1990,Alain Fischer，2003,（一）基因治療的曲折發(fā)展,2003 Adrian Thrasher,1990 Fresh Anderson,1969 Concept of gene therapy,1999年美國 Univ.of Pennsylvania 一例患者在接受腺病毒介導(dǎo)的基因治療過程中死亡。 2002-2003年

4、法國Necker-Enfants兒童醫(yī)院11例SCID患者接受了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因治療其中3例治愈后出現(xiàn)白血病樣癥狀。,Jesse Gelsinger，1999,Ashanti de Silva，1990,Alain Fischer，2003,基因治療遭遇的挫折,Nature 2003,January,421,305,Nature Biotechnology 2003,Febuary,vol 21,121,The Cause of

5、Leukemia:Insertion of activating retrovirus vector in Pro-oncogene LOM2 Locus.,,,,,EX 1,,,,,,Patient 5 Integration,Patient 4 Integration,MFG γC,MFG γC,EX 2,EX 6,,,,,LOM2,全世界基因治療臨床試驗(yàn)共1714項(xiàng),USA,UA,Australia,Germany,（二）S

6、trategy of Gene Therapy,To transfer a repair gene into a patient, the researchers must go through several steps :They must isolate the disease-related gene;It must be packaged in a vector, usually a disabled virus that

7、 cannot reproduce and cause disease, but that can act like a delivery truck to transport the gene inside the patient’cells;Once inside the body’s cells, the new gene can begin to function and restore health.,基因治療的必要條件,1

8、、發(fā)病機(jī)制在DNA水平上已經(jīng)清楚；2、要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解；3、該基因正常表達(dá)的組織可在體外進(jìn)行遺傳操作理想的基因治療還必須：1、外源基因可有效導(dǎo)入靶細(xì)胞2、外源基因能在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定存留3、導(dǎo)入基因能適量表達(dá)4、導(dǎo)入基因的方法及載體對宿主細(xì)胞安全無害,腺病毒模式圖,利用第2代腺病毒載體（E1區(qū)和部分E3區(qū)缺失，E2A部分修飾），將人內(nèi)皮抑素基因（human endostatin gene）的

9、表達(dá)盒，插入E1區(qū)，構(gòu)建新型重組人內(nèi)皮抑素腺病毒。,構(gòu)建新型重組人內(nèi)皮抑素腺病毒,,Fundamentals of Gene Therapy,The Gene Therapy of Severe Combine Immune Deficiency（SCID）,（三）腫瘤基因治療的研究策略,1、抗腫瘤細(xì)胞因子基因治療 通過將抗腫瘤細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞或機(jī)體特定細(xì)胞使其持續(xù)高效分泌這種細(xì)胞因子以達(dá)到殺瘤目的的療法。（如腫瘤

10、壞死因子）。2、修正腫瘤相關(guān)基因的功能1）恢復(fù)抑癌基因的功能 最具代表性的腫瘤抑制基因?yàn)閜53基因。現(xiàn)已有腺病毒載體攜帶的p53基因治療。2）糾正癌基因的過度表達(dá) 利用反義RNA、核酸或肽核酸等反義技術(shù)及RNA干涉技術(shù)等 特異性地封閉基因表達(dá)的特性,抑制一些癌基因的過度表達(dá),以 達(dá)到治療疾病的目的。如利用反義癌基因?qū)盒阅[瘤的治療。,3、自殺基因治療：這類治療方案的原理是將編碼某種酶的基因（自殺基

11、因）轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，這種酶能使某種藥物轉(zhuǎn)化為對細(xì)胞有害的物質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞DNA不能復(fù)制而死亡，這種藥物對正常細(xì)胞無毒害作用。例如：5－氟胞嘧啶系統(tǒng)。4、藥物抗性基因轉(zhuǎn)移治療：增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞藥物敏感性和提高正常細(xì)胞對化療藥物的耐受性。給腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入某些藥物敏感基因可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性；相反，耐藥基因治療則是對正常細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其具有比腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的對化療藥物的耐受力。,（四）基因治療的載體,基因治療載體可分兩大類: 病毒性

12、載體和非病毒性載體。1、病毒性載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒、皰疹病毒等；2、非病毒載體：裸露ＤＮＡ、陽離子脂質(zhì)體、ＤＮＡ包裝顆粒等,NIH & FDA: AAV Vector is the Most Safe Viral Vector for Gene Therapy,1. Non-pathogenic ，2. Inhibit replication of pathogenic virus， 3. I

13、nhibit oncogenesis,1、沒有致病性, AAV 是缺陷型病毒, 只能潛伏感染,不 能自主復(fù)制；2、可特異位點(diǎn)整合, AAV 可特異整合于人19 號染色 體上, 從而避免隨機(jī)整合導(dǎo)致細(xì)胞突變的危險(xiǎn)。而且 染色體的整合可使轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因長期穩(wěn)定表達(dá)；3、免疫源性弱,避免了病毒自身蛋白引起的免疫反應(yīng)；4、感染的宿主細(xì)胞包括靜止細(xì)胞和分裂細(xì)胞。 AAV載體不能插入較大的外源基因，缺少高

14、效的包 裝細(xì)胞，制備過程復(fù)雜，制備滴度低等缺陷。,病毒是一種可利用的基因治療載體，它們對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的感染效率很高，能在靶細(xì)胞中高效表達(dá)目的基因。目前認(rèn)為腺相關(guān)病毒(AAV)是人類基因治療研究中最理想的病毒載體之一，它較其他病毒載體有如下的優(yōu)點(diǎn):,（五）腫瘤基因治療的臨床應(yīng)用,腫瘤基因治療的策略主要包括： 抑癌基因替換治療； 抑制細(xì)胞表面生長因子受體基因治療； 抗血管生成基因治療。 其中，以p5

15、3抑癌基因替換治療研究開展的臨床試驗(yàn)最為廣泛。目前發(fā)現(xiàn)多數(shù)惡性實(shí)體瘤含有p53的突變，臨床上采用腺病毒轉(zhuǎn)入野生型p53基因可在體內(nèi)外抑制含有p53的突變癌細(xì)胞的生長，在此基礎(chǔ)上研究者們開展了相關(guān)的臨床試驗(yàn)。,1、重組人p53腺病毒注射液（今又生），是一種廣譜抗癌藥，用于治療頭頸部鱗癌等惡性腫瘤，是經(jīng)國家藥品食品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的世界首個(gè)基因治療藥物。2、安柯瑞（重組人5型腺病毒注射液）：它利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)P53基因及其通路的變異，能識別腫

16、瘤細(xì)胞并將其殺死。適應(yīng)癥：晚期鼻咽癌。3、恩度(針劑)：重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液， 作用機(jī)理是通過抑制形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞遷移來達(dá)到抑制腫瘤新生血管的生成，阻斷了腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給，從而達(dá)到抑制腫瘤增殖或轉(zhuǎn)移目的。,目前在我國已上市的腫瘤基因治療藥物,二、腫瘤免疫治療,腫瘤的免疫治療是以激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能或通過生物制劑的作用以調(diào)節(jié)機(jī)體自身的免疫反應(yīng),從而達(dá)到治療腫瘤的目的。 目前臨床上有許多腫瘤免疫治療的新觀點(diǎn)，臨床

17、方法多種多樣，一些臨床結(jié)果令人振奮，盡管有許多問題仍有待解決，但是可以樂觀的認(rèn)為主動(dòng)免疫治療和過繼性細(xì)胞免疫治療將以一種更加有效的方式來對抗腫瘤。,（一）腫瘤免疫理論的建立,腫瘤免疫的概念起源于上世紀(jì)初。1909年Ehrlich首先提出，免疫系統(tǒng)不僅負(fù)責(zé)防御微生物侵犯，而且能從機(jī)體內(nèi)清除改變了的宿主成分。并提出了細(xì)胞免疫直接對抗腫瘤的概念，此后人們認(rèn)識到癌細(xì)胞是改變了的宿主成分。上個(gè)世紀(jì)末，感染性疾病病原的發(fā)現(xiàn)和接種疫苗可以誘導(dǎo)免疫系

18、統(tǒng)產(chǎn)生對抗疾病的保護(hù)效應(yīng)，對醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。正是以這些理論和原理為背景，產(chǎn)生了最初的理論，提出抗腫瘤保護(hù)性免疫反應(yīng)的存在以及誘導(dǎo)和擴(kuò)大這種反應(yīng)的可能性。,六十年代經(jīng)Thomas、Burnet和Good等人將該觀點(diǎn)系統(tǒng)化，提出了免疫監(jiān)視學(xué)說。免疫監(jiān)視學(xué)說的中心思想是：免疫系統(tǒng)具有一個(gè)十分完備的監(jiān)視功能，能準(zhǔn)確地分辨“自己”和“非己”的成分；它不僅能清除外界侵入的各種微生物，排斥同種異體移植物，而且還能消滅機(jī)體內(nèi)突變的細(xì)胞，防止腫

19、瘤的生長，保護(hù)機(jī)體的健康。每當(dāng)免疫監(jiān)視功能由于這種或那種原因被消弱時(shí)，便為腫瘤的發(fā)生提供了有利條件；如果機(jī)體不具備免疫監(jiān)視功能，人類的腫瘤發(fā)病率會大大的提高。,（二）腫瘤免疫治療的方法,1、細(xì)胞因子療法 (IL-2, IFN-γ,IL-12,TNF-a)；2、生物分子靶向藥物：1）美羅華 注射液（利妥昔單抗注射液 ） 利妥昔單抗是一種嵌合鼠/人的單克隆抗體，該抗體與細(xì)胞膜的CD20抗原結(jié)合。如與B細(xì)胞上的CD20抗原結(jié)合，可引發(fā)

20、B細(xì)胞的溶解反應(yīng)。適用于復(fù)發(fā)或化療抵抗性B淋巴細(xì)胞型非何杰金氏淋巴瘤的病人。2）抗人細(xì)胞表皮生長因子的單克隆抗體（C225） 西妥昔單體（cetuximab）為IgG1單克隆抗體，是表皮生長因子受體（EGFR）阻止劑，通過干擾腫瘤細(xì)胞表面的EGFR蛋白質(zhì)的生長，達(dá)到抗腫瘤的目的。目前用于治療晚期結(jié)腸癌。,3）抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）配體的單克隆抗體（Avastin）: 研究發(fā)現(xiàn)VEGF在多種腫瘤，如腦瘤、肺癌、乳癌、

21、消化道腫瘤及泌尿道腫瘤等均有過度表達(dá)。 Avastin通過抑制VEGF的生物學(xué)活性，減少腫瘤新血管的形成，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，適用于聯(lián)合以5－FU為基礎(chǔ)的化療方案一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。4）表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（Iressa）； 藥名吉非替尼，是一種選擇性表皮生長因子受體（EGFR）酪 氨酸激酶抑制劑，該酶通常表達(dá)于上皮細(xì)胞來源的實(shí)體瘤。適合于接受化療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌。5）表皮生長

22、因子受體（EGFR）抑制劑特羅凱（Tarceva ）： 它也是一種EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)磷酸化的阻斷劑。研究顯示，40－85%的非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR呈陽性，Tarceva的作用機(jī)理與Iressa相似，都是抑制在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)的EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)的活性而達(dá)到治療腫瘤的目的。,6）甲苯磺酸索拉非尼 (sorafenib)，多吉美 索拉非尼是首個(gè)口服多激酶抑制藥,靶向作用于腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管上的絲氨酸和(或)蘇氨酸及受

23、體酪氨酸激酶,阻斷信號傳導(dǎo),抑制腫瘤生長。2005年底經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市,用于進(jìn)展性腎臟細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性或晚期肝細(xì)胞癌的治療。 7）蘋果酸舒尼替尼（sunitinib，sutent），索坦/SUTENT舒尼替尼是一種能抑制多個(gè)受體酪氨酸激酶的小分子，其中某些受體酪氨酸激酶參與腫瘤生長、病理性血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，美國FDA 2006年1月批準(zhǔn)舒尼替尼用于治療胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)和不能手術(shù)的轉(zhuǎn)移腎細(xì)胞癌（MRCC）。,3、腫瘤疫苗

24、療法,腫瘤疫苗治療腫瘤是利用腫瘤細(xì)胞抗原或相應(yīng)的核酸 進(jìn)行治療腫瘤的方法。主要包括以下幾種： （1）基因修飾的腫瘤疫苗； （2）熱休克蛋白疫苗； （3）腫瘤抗原肽疫苗； （4）核酸疫苗； （5）樹突狀細(xì)胞（DC）疫苗 （6）DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗； （7）CA125的抗獨(dú)特型抗體ACA125疫苗； （8）預(yù)防宮頸癌發(fā)生的HPV疫苗。,樹突狀細(xì)胞（DC）源自骨髓中的前體細(xì)胞，是已知機(jī)體內(nèi)

25、抗原呈遞能力最強(qiáng)的細(xì)胞，比普通抗原呈遞細(xì)胞強(qiáng)1000倍，它能在機(jī)體內(nèi)外捕獲抗原后，將信息傳遞給T、B淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)一系列的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。但該種細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)含量極低，占正常人外周血白細(xì)胞的1％左右。 近年來，聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子體外培養(yǎng)大量DC獲得成功，為其功能及分化狀態(tài)的深入研究和在腫瘤生物治療領(lǐng)域中的應(yīng)用創(chuàng)造了條件。因具有長長的樹突狀突起和星狀多形性而得名。,（1）樹突狀細(xì)胞疫苗,樹突狀細(xì)胞（DC）是功能最強(qiáng)的抗原遞呈

26、細(xì)胞，發(fā)揮重要的抗腫瘤功能,DC 腫瘤抗原攝取 誘導(dǎo)CTLs 對腫瘤細(xì)胞特異殺傷,,,2010.4.29 美國食品藥品管理局批準(zhǔn) Provenge (sipuleucel-T)，作為一種治療晚期前列腺癌患者的免疫活性細(xì)胞，這標(biāo)志著癌癥進(jìn)入一種新的治療：自身免疫活性細(xì)胞治療。利用前列腺癌組織中高表達(dá)的一種抗原，由DC負(fù)載這種抗原刺激自體的T淋巴細(xì)胞。將這些經(jīng)體外刺激擴(kuò)增的免疫活性細(xì)胞回輸給前列腺癌患者達(dá)到治療的目的。,,De

27、ndritic Cells,Highly specialized antigen presenting cellsActivate naïve T cellsGenerate cell-mediated immune response,Immature Dendritic Cell(Periphery),Mature Dendritic Cell(Lymphoid),人成熟DC的掃描電鏡圖,2011年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

28、,,,Bruce A. Beutler Jules A. Hoffmann Ralph M. Steinman,2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)揭曉，美國、法國三位科學(xué)家因在免疫學(xué)方面的發(fā)現(xiàn)獲獎(jiǎng)。其中一半的獎(jiǎng)金歸于Bruce A. Beutler和Jules A. Hoffmann，獲獎(jiǎng)理由是在“Toll樣受體和先天免疫激活方面的發(fā)現(xiàn)”；另一半獎(jiǎng)金歸于Ralph M. Steinman，獲獎(jiǎng)理由是“發(fā)現(xiàn)

29、樹突狀細(xì)胞及其在獲得性免疫中的作用”。 美籍科學(xué)家比尤特勒和盧森堡籍科學(xué)家霍夫曼是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)“Toll樣受體（Toll-like Receptors，TLRs）及其配體”獲得2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)一種自體免疫活性細(xì)胞治療前列腺癌的細(xì)胞類藥,2010.4.29 美國食品藥品管理局批準(zhǔn) Provenge (sipuleucel-T)，作為一種治療晚期前列腺癌患者的免疫活性細(xì)胞，這標(biāo)志著癌癥進(jìn)入一種新的治療：

30、自身免疫活性細(xì)胞治療。 Provenge誘導(dǎo)作用是通過抗原提呈細(xì)胞(APCs)負(fù)載前列腺癌酸性磷酸酶（PAP）抗原，繼而激活腫瘤特異的CD8+T細(xì)胞，殺滅前列腺癌細(xì)胞。這是FDA批準(zhǔn)的第一種自體細(xì)胞免疫療法。,Provenge疫苗治療方案,GM-CSF-PAP治療機(jī)制,受試者：512名總體生存期：對照組 21.7個(gè)月，治療組25.8個(gè)月。3年存活率： 治療組 32% ，對照組只有23%。副作用：主要是發(fā)燒、發(fā)冷、疲勞和

31、疼痛。,治療結(jié)果,,DC疫苗的制備,BMDC,GM-CSF, IL-4, TNFα,成熟的DC,培養(yǎng)6~8 days,,,TNFα, IL-4GM-CSF,,PBDC,,,加腫瘤抗原,人成熟DC表型的流式細(xì)胞檢測（可見CD 80, CD 83，CD86高表達(dá)）,DC腫瘤疫苗制備流程,如何獲得高純度的腫瘤抗原？,國家發(fā)明專利---人腫瘤細(xì)胞的分離純化方法,未純化的人肺癌細(xì)胞,純化后的肺癌細(xì)胞,從肺癌腫瘤患者胸腹水中分離肺癌細(xì)胞,貼壁生

32、長的肺癌細(xì)胞,從手術(shù)后腎癌組織中分離純化腎癌細(xì)胞,未純化的人腎癌細(xì)胞,純化后的腎癌細(xì)胞,貼壁生長的腎癌細(xì)胞,從術(shù)后卵巢癌組織中分離純化卵巢癌細(xì)胞,未純化的人卵巢癌細(xì)胞,純化的人卵巢癌細(xì)胞,貼壁生長的卵巢癌細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞疫苗在實(shí)體瘤治療中的策略（1）,,抽病人50ml-60ml外周血,分離單核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞,DC細(xì)胞負(fù)載自體腫瘤抗原，通過靜脈回輸給病人或經(jīng)皮下注射,經(jīng)腫瘤抗原負(fù)載DC細(xì)胞能刺激自體T細(xì)胞,產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)

33、答。,,,,,樹突狀細(xì)胞疫苗在實(shí)體瘤治療中的策略（2）,,抽病人50ml-60ml外周血,分離單核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞,DC細(xì)胞負(fù)載自體腫瘤抗原并與自體的淋巴細(xì)胞混合，刺激自體T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,將這些細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞通過靜脈回輸給病人,直接殺傷腫瘤腫瘤細(xì)胞,,,,,（2）樹突狀細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合 疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生主動(dòng)抗腫瘤免疫,樹突狀細(xì)胞表達(dá)高水平的共刺激分子，能在體內(nèi)外直接激活初始T細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的起始

34、，促進(jìn)T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxical T lymphocyte CTL)的生成，也能促進(jìn)B細(xì)胞生成抗體。 近年來，隨著對DC攝取、遞呈抗原機(jī)理的不斷認(rèn)識, DC培養(yǎng)方法的不斷成熟和完善，針對腫瘤的免疫原性弱的免疫特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。,腫瘤細(xì)胞表面抗原的多樣性,腫瘤細(xì)胞模式圖,腫瘤抗原免疫原性弱，難以激活有效的機(jī)體免疫,人乳腺癌細(xì)胞電鏡掃描圖,分化成熟的DC模式圖,

35、,Strategy of Fusion,,,DC與腫瘤細(xì)胞融合,自體DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗,原代腫瘤細(xì)胞,成熟DC細(xì)胞,自體DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗,,,,,PBMNC（50-60ml）,融合,,TNFα, IL-4GM-CSF,腫瘤細(xì)胞純化技術(shù),,,,術(shù)后腫瘤組織,,自體DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗治療策略（1）,抽病人50ml-60ml外周血,分離單核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞,DC/融合細(xì)胞疫苗經(jīng)皮下注射,DC/融合細(xì)胞疫苗能刺激自體T細(xì)

36、胞,誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗腫瘤免疫應(yīng)答。,,,,,制備DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗,,,自體DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗治療策略（2）,抽病人50ml-60ml外周血,分離單核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞,DC/腫瘤融合細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合，刺激產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞通過靜脈回輸給病人,直接殺傷腫瘤細(xì)胞,,,,,,制備DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗,,,（1）抗原激活的殺傷細(xì)胞(TAK)；（2）腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TIL）；（3）細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(

37、CTL)；（4）激活的殺傷性單核細(xì)胞(AKM)；（5）自然殺傷細(xì)胞(NK)；（6）細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)。,2、腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療 向腫瘤患者輸入具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。主要包括以下幾類：,過繼性細(xì)胞免疫治療的過程,（1）CIK細(xì)胞治療腫瘤,“CIK細(xì)胞” 是將人的外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子（如抗CD3McAb, IL-2, IF

38、N-γ, IL-1α等）共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，由于該種細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。目前，CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼免疫治療的方案之一.,,自體CIK細(xì)胞的制備,PBMNC 0.5-3×107（50ml）,24 個(gè)175cm的培養(yǎng)瓶,IFNγIl-2CD3 mAbIL 1α,12-

39、14 days 1~1.5×1010,,,,經(jīng)淋巴細(xì)胞亞群檢測，CIK細(xì)胞的中CD3CD56雙陽性細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到42.35%，,（2）自體DC細(xì)胞激活的CIK細(xì)胞治療腫瘤,通過體外誘導(dǎo)有功能的自體DC細(xì)胞，將這種有功能的自體DC細(xì)胞激活自體CIK細(xì)胞，產(chǎn)生一種更強(qiáng)的抗腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞（DC-CIK細(xì)胞），從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DC-CIK細(xì)胞能促進(jìn)IL-12和INF-γ的分泌，提高細(xì)胞毒性，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

40、，,自體DC-CIK 細(xì)胞的制備,,CIK細(xì)胞,成熟DC細(xì)胞,DC細(xì)胞刺激的CIK細(xì)胞（ 1~1.5×1010 ）,,,,,PBMNC 0.5-3×107（50ml）,共培養(yǎng),,TNFα, IL-4GM-CSF,IFN γ Il-2CD3 mAbIL 1α,,,,DC刺激的自體CIK細(xì)胞的表型,自體CIK、DC-CIK在惡性腫瘤治療中的策略,,抽腫瘤患者外周血（50－60ml）,體外誘導(dǎo)CIK、DC-C

41、IK細(xì)胞 (1x1010以上),回輸CIK、DC-細(xì)胞給患者(至少4次),殺傷殘留的腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,,,,（3）自然殺傷細(xì)胞（NK cells）治療腫瘤,NK細(xì)胞來源于造血細(xì)胞，其發(fā)育成熟依賴骨髓及胸腺微環(huán)境。具有抗細(xì)菌和病毒感染的作用，近來發(fā)現(xiàn)它們無需抗原預(yù)先作用，就可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中起重要作用。,,自體自然殺傷細(xì)胞（NK cells）,PBMNC （30-40ml 外周血

42、）,12 個(gè)175cm的培養(yǎng)瓶,誘導(dǎo)NK培養(yǎng)試劑IL-2,NK細(xì)胞數(shù)量可達(dá) 2~3×109,,,,培養(yǎng)12-14天,經(jīng)淋巴細(xì)胞亞群檢測，NK細(xì)胞的平均含量達(dá)到82.2 +/- 5.5%，,自體NK細(xì)胞的治療策略,抽腫瘤患者外周血(30-40ml),體外誘導(dǎo)NK細(xì)胞,每周回輸一次NK細(xì)胞給患者（至少4次）,回輸?shù)腘K細(xì)胞能提高機(jī)體免疫功能,殺傷殘留的腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,,,,,微創(chuàng)介入聯(lián)合CIK治療原發(fā)性肝癌,M

43、inimally Invasive Treatment Combined with Cytokine-Induced Killer Cells Therapy Lower the Short-Term Recurrence Rates of Hepatocellular Carcinomas. 1. Weng DS, Zhou J, Zhou QM, Zhao M, Wang QJ, Huang LX, Li YQ, Chen SP

44、, Wu PH, and Xia JC, Minimally invasive treatment combined with cytokine-induced killer cells therapy lower the short-term recurrence rates of hepatocellular carcinomas. J Immunother, 2008, 31 (1): 63-71.,體細(xì)胞免疫治療聯(lián)合常規(guī)療法增

45、效舉例,肝癌的手術(shù)和局部病癥的栓塞化療（TACE and Operation） —— 器官水平的整體治療（Entirety therapy in organ-level ） 射頻消融（RFA ） —— 局部的強(qiáng)化治療（Focal intensive therapy）體細(xì)胞免疫治療（Adoptive cell Immuninotherapy —— 殺傷微小的腫瘤病灶（Aim directly at m

46、icroscopic lesions or sub-image lesions）,原發(fā)性肝癌個(gè)體化治療模式研究,,,The expression of surface markers of CIK cells from 1 patient. The percentages of CD3+CD56+, were 34.5%,,Figure 5　85名原發(fā)肝癌患者生存曲線CIK治療組6、12、18個(gè)月時(shí)無復(fù)發(fā)生存率分別為93.3%、 9