抗體工程概述

1、抗體工程,廖振林 Tel：68914Email：602581821@qq.com,食品學院微生物教研室,概 述,概 述,講述內容,1 抗原2 抗體3 多克隆抗體4 細胞工程抗體5 基因工程抗體6 抗體的分離純化與鑒定7 抗體的應用及免疫學檢驗技術,,抗體基本結構,免疫球蛋白的基本結構,,,抗體攻擊病毒,凝集細菌,,抗 SARS 的單抗,SARS-CoV,抗體 是對其抗原有極強專一性 的魔彈 或 巡航導彈,研 究以免疫

2、轉印法檢測 特定抗原醫(yī) 療以毒素連結抗體攻擊 病變細胞檢 驗以 ELISA 偵測特定 病原體,抗體藥物銷售趨勢圖,表 已批準上市的治療性單抗,2001,淋巴瘤,CD52,人源化抗體,Campath,2000,淋巴瘤,CD33,人源化抗體化療藥物交聯(lián)物,Mylotarg,1998,移植排斥,,兔多抗,Thymogloblin,1998,RSV感染,RSV F蛋白,人源化抗體,Synagis,1998,乳腺癌,HER-2,人源化

3、抗體,Herceptin,19981999,炎癥性腸病類風濕關節(jié)炎,TNF-α,人-鼠嵌合抗體,Remicade,1998,移植排斥,CD25,人-鼠嵌合抗體,Simulect,1997,淋巴瘤,CD20,人-鼠嵌合抗體,Rituxan,1997,移植排斥,CD25,人源化抗體,Zenapax,1994,冠心病,血小板受體ⅡbⅢa,人-鼠嵌合Fab,ReoPr o,1995,大腸癌,17-1A,鼠單抗,Panorex,1986,移植排

4、斥,CD3,鼠單抗,OKT3,批準日期,適應癥,靶向抗原,抗體種類,抗體名稱,,,,,生物技術,生物技術制藥,基因工程藥物（蛋白類藥物）,人源化治療性單克隆抗體藥物,基因治療技術,現(xiàn)代中藥,,,● 至2000年底，在美國藥品市場上生物技術藥物有76種，其中抗體藥物有15種?！?2003年治療用單抗銷售總額已超過52億美元?！?2006年預計50-60個治療性單抗上市?！?2010年預計單抗銷售額200億美元?！?美國已占全球單

5、抗市場90%—一支獨秀?！?完全人源化單抗現(xiàn)有多個處于臨床前階段,抗體生成技術,,Epitope, Antigenic determinant,抗原決定基,● 一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基,● 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗體,● 蛋白質性 抗原決定基 含有六個以上氨基酸,,整體水平抗體生成技術,細胞工程抗體生成技術,基因工程抗體生成技術,,,多克隆抗體（抗血清）,單克隆抗體,嵌合抗體、改形抗體,“小型化抗體”（單鏈抗體

6、）,組合抗體庫技術,噬菌體抗體庫技術,Ig基因轉基因小鼠,抗體真核表達技術,多克隆抗體,多克隆抗體（polyclonal antibody） 指由不同B細胞克隆產生的針對抗原物質中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。 如:免疫血清（含多種特異性抗體）。 實際意義： （1）預防、治療感染性疾病， 如：破傷風抗毒素血清 ? 抗破傷風， 胎盤球蛋白? 抗病毒感染等 副作用：?超敏反應

7、（2）臨床診斷，如：肥達氏反應 -- 傷寒、副傷寒 缺點：特異性差。,傳統(tǒng)抗血清,抗 原,免 疫,,,所有抗體混合,1,2,3,4,,,,脾 臟,淋巴結,B 細胞,傳統(tǒng)抗血清的交叉反應,專一性反應,沒有反應,交叉反應,+,-,?,,1 2 3 Ag A,x y z Ag B,1’ 2 0 Ag A’,單克隆抗體,,可生產有用抗體的 淋巴細胞

8、 若與 癌細胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細胞株。,癌細胞可培養(yǎng)生長,漿細胞B cell可分泌抗體,,融合瘤Hybridoma,,細胞融合,兩組染色體混在一起,也可以培養(yǎng)生長產生專一性抗體,一個 B cell 只產生一種抗體,,,● 一個 B 細胞只能生產一種抗體，對付某一 抗原決定基。,● 若有許多抗原決定基，則需許多株 B 細胞分別生產許多抗體。,B,B,B,Y,Y,Y,Y,,,,,,抗 原,,B,,Y,B,,親和

9、力成熟,1,1,2,3,4,抗原決定基,1,2,3,4,1,2,3,4,單抗,細胞融合,取出脾細胞,,,+癌細胞,各抗體分開,,,1,2,3,4,,m,核酸補救合成,m,核酸從頭合成,核酸,,,氨甲喋呤(A),,(-),次黃嘌呤(H)\胸苷(T),,TK,HGPRT,,TK-,HGPRT-,抗體,,-a,-b,-c,-d,,,,,,,-a -b -c -d,BALB/c,a,b,b,c,d,傳統(tǒng)抗體

10、(抗血清) 是所有抗體的混和,脾臟產生各種 B 細胞,免疫前要先把抗原作成乳劑,免疫,抗原,采血后可得傳統(tǒng)抗血清,,,已建立之小鼠骨髓癌細胞株,由脾臟收集 B 細胞,抗原通常有多個抗原決定基,免疫后的脾臟,約在兩月內注射五到八次,Ag X,,,細胞融合,AgX,AgX’,ELISA,HAT,PEG Cell fusion,Hybridoma cells 融合瘤細胞,（Subcloning） (確定只有一種細胞)

11、,d’,d,abcd,abcd’,++++,+++-,X,-d,-c,-b,-a,+,-,-d,,,,,,分株培養(yǎng)篩選,篩選,單抗,傳統(tǒng)抗體 (抗血清),試驗專一性,對抗原的反應,無法分辨,完全不同,,基因工程抗體,,1 人一鼠嵌合抗體(Chimeric Antibodies),人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。,構建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)

12、基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。,構建重組表達載體,克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術分離。 人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調整其效應。,人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人

13、體內應用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關抗原)的嵌合抗體。,2 鼠單抗可變區(qū)的人源化,盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術。 CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。,經過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結合能力保持不變，結合半抗原及全抗原(如細胞表面

14、受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）,人源化抗體的構建可用全合成法或定點突變法。 全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質粒中，進一步即可用于構建和表達改形抗體。,定點突變法

15、是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。,研究表明，在構建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構建時還必需包括對影響抗原結合位點的空間結構的框架序列進行操作。,小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。 小分子抗體有很多優(yōu)點: 可以用細菌發(fā)酵生產，成本低

16、; 分子小，穿透力強; 不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應; 在體內循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標抗體等。,3 小分子抗體,,,,,,,Fv,ScFv,單區(qū)抗體,最小識別單位,,,,Fab,,,,,由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 把Fab與細菌的前導肽相連，在前導肽的作用下Fab進入質周腔，裝配折疊后，它具有結合抗原的活性。,

17、(1)Fab,,Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,,Fv,,,ScFv,連接肽,,Fv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不穩(wěn)定。 在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。 連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應具有柔軟性，側鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。,單鏈抗體的構建在已知親本DNA序列時可用

18、完全人工合成法; 在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時，可用定點突變法在其兩端造成適當?shù)膬惹忻肝稽c，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達載體中; 如果從雜交瘤細胞系構建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區(qū)基因，再組裝到適當?shù)谋磉_載體上。,單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌，有2種方式: 一是表達為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產量高，可達細菌蛋白總量的5%-20%，但需進行變性復性，使其形成正確的立體結構，恢復抗體活性;

19、 二是分泌型表達，將細菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質周腔和細菌體外，進行折疊后成為有活性的分子。但產量不及前者，一般實驗室培養(yǎng)條件下每升細菌的產量僅在數(shù)毫克左右。,即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。,(3)單域抗體,VH,約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性。,(4)最小

20、識別單位,,CDR,,,4 雙特異抗體和多價抗體,,雙鏈抗體 （Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。,雙特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應腫瘤相關抗原。另1種為對應效應成分。 即能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞,將效應細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引

21、發(fā)分子結合,激活效應細胞,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。,Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質粒中,構建成雙鏈抗體的表達質粒,目前報道的表達質粒均為雙順反子。表達后,VLA VHB與VHA VLB交叉連結,形成雙特異性抗體。,所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細胞外,

22、還能將循環(huán)血液中的免疫效應細胞再導向至腫瘤細胞處,從而使效應細胞的抗腫瘤活性增強,發(fā)揮免疫導向作用,這是腫瘤治療的新突破。,抗體庫技術是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達，然后篩選出所需的特異基因和抗體。 PCR技術; 免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達; 噬菌體表面展示文庫技術。,5 抗體庫技術,初期的抗體庫技術是從淋巴細胞中提取總RNA，反

23、轉錄成cDNA或直接用總DNA為模板，用PCR技術建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達后篩選。,它是在PCR技術和Phage Display的基礎上實現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與P Ⅲ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進行篩選。,噬菌體抗體庫技術,1990年Mc Caffert

24、y等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。,噬菌體表面展示系統(tǒng)(phage surface display system ),噬菌體表面展示文庫技術的要點:,外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端,將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8

25、 的先導系列的緊靠下游,隨機克隆入相應載體形成組合文庫,從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段,,,,用固相化抗原經“親和結合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。,使翻譯出的抗體分泌到細菌的質周腔內，形成游離的抗體片段，經過純化即可獲得目的抗體。,,篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉入大腸桿菌，,,,該項技術的優(yōu)點: 將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;

26、 可繞過雜交瘤技術，不需要復雜的基因工程技術; 抗體基因篩選的范圍廣; 技術穩(wěn)定、可靠、生產周期短;可規(guī)模化生產; 適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產。,噬菌體抗體庫技術的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識別一增殖過程上模擬了B細胞的成熟過程，從而在實際應用上具有很大意義。,6 轉人Ig基因小鼠,獲取