抗體工程概述

1、抗體工程,廖振林 Tel：68914Email：602581821@qq.com,食品學(xué)院微生物教研室,概 述,概 述,講述內(nèi)容,1 抗原2 抗體3 多克隆抗體4 細胞工程抗體5 基因工程抗體6 抗體的分離純化與鑒定7 抗體的應(yīng)用及免疫學(xué)檢驗技術(shù),,抗體基本結(jié)構(gòu),免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),,,抗體攻擊病毒,凝集細菌,,抗 SARS 的單抗,SARS-CoV,抗體 是對其抗原有極強專一性 的魔彈 或 巡航導(dǎo)彈,研 究以免疫

2、轉(zhuǎn)印法檢測 特定抗原醫(yī) 療以毒素連結(jié)抗體攻擊 病變細胞檢 驗以 ELISA 偵測特定 病原體,抗體藥物銷售趨勢圖,表 已批準(zhǔn)上市的治療性單抗,2001,淋巴瘤,CD52,人源化抗體,Campath,2000,淋巴瘤,CD33,人源化抗體化療藥物交聯(lián)物,Mylotarg,1998,移植排斥,,兔多抗,Thymogloblin,1998,RSV感染,RSV F蛋白,人源化抗體,Synagis,1998,乳腺癌,HER-2,人源化

3、抗體,Herceptin,19981999,炎癥性腸病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,TNF-α,人-鼠嵌合抗體,Remicade,1998,移植排斥,CD25,人-鼠嵌合抗體,Simulect,1997,淋巴瘤,CD20,人-鼠嵌合抗體,Rituxan,1997,移植排斥,CD25,人源化抗體,Zenapax,1994,冠心病,血小板受體ⅡbⅢa,人-鼠嵌合Fab,ReoPr o,1995,大腸癌,17-1A,鼠單抗,Panorex,1986,移植排

4、斥,CD3,鼠單抗,OKT3,批準(zhǔn)日期,適應(yīng)癥,靶向抗原,抗體種類,抗體名稱,,,,,生物技術(shù),生物技術(shù)制藥,基因工程藥物（蛋白類藥物）,人源化治療性單克隆抗體藥物,基因治療技術(shù),現(xiàn)代中藥,,,● 至2000年底，在美國藥品市場上生物技術(shù)藥物有76種，其中抗體藥物有15種?！?2003年治療用單抗銷售總額已超過52億美元?！?2006年預(yù)計50-60個治療性單抗上市?！?2010年預(yù)計單抗銷售額200億美元?！?美國已占全球單

5、抗市場90%—一支獨秀。● 完全人源化單抗現(xiàn)有多個處于臨床前階段,抗體生成技術(shù),,Epitope, Antigenic determinant,抗原決定基,● 一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基,● 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗體,● 蛋白質(zhì)性 抗原決定基 含有六個以上氨基酸,,整體水平抗體生成技術(shù),細胞工程抗體生成技術(shù),基因工程抗體生成技術(shù),,,多克隆抗體（抗血清）,單克隆抗體,嵌合抗體、改形抗體,“小型化抗體”（單鏈抗體

6、）,組合抗體庫技術(shù),噬菌體抗體庫技術(shù),Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠,抗體真核表達技術(shù),多克隆抗體,多克隆抗體（polyclonal antibody） 指由不同B細胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。 如:免疫血清（含多種特異性抗體）。 實際意義： （1）預(yù)防、治療感染性疾病， 如：破傷風(fēng)抗毒素血清 ? 抗破傷風(fēng)， 胎盤球蛋白? 抗病毒感染等 副作用：?超敏反應(yīng)

7、（2）臨床診斷，如：肥達氏反應(yīng) -- 傷寒、副傷寒 缺點：特異性差。,傳統(tǒng)抗血清,抗 原,免 疫,,,所有抗體混合,1,2,3,4,,,,脾 臟,淋巴結(jié),B 細胞,傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng),專一性反應(yīng),沒有反應(yīng),交叉反應(yīng),+,-,?,,1 2 3 Ag A,x y z Ag B,1’ 2 0 Ag A’,單克隆抗體,,可生產(chǎn)有用抗體的 淋巴細胞

8、 若與 癌細胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細胞株。,癌細胞可培養(yǎng)生長,漿細胞B cell可分泌抗體,,融合瘤Hybridoma,,細胞融合,兩組染色體混在一起,也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體,一個 B cell 只產(chǎn)生一種抗體,,,● 一個 B 細胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一 抗原決定基。,● 若有許多抗原決定基，則需許多株 B 細胞分別生產(chǎn)許多抗體。,B,B,B,Y,Y,Y,Y,,,,,,抗 原,,B,,Y,B,,親和

9、力成熟,1,1,2,3,4,抗原決定基,1,2,3,4,1,2,3,4,單抗,細胞融合,取出脾細胞,,,+癌細胞,各抗體分開,,,1,2,3,4,,m,核酸補救合成,m,核酸從頭合成,核酸,,,氨甲喋呤(A),,(-),次黃嘌呤(H)\胸苷(T),,TK,HGPRT,,TK-,HGPRT-,抗體,,-a,-b,-c,-d,,,,,,,-a -b -c -d,BALB/c,a,b,b,c,d,傳統(tǒng)抗體

10、(抗血清) 是所有抗體的混和,脾臟產(chǎn)生各種 B 細胞,免疫前要先把抗原作成乳劑,免疫,抗原,采血后可得傳統(tǒng)抗血清,,,已建立之小鼠骨髓癌細胞株,由脾臟收集 B 細胞,抗原通常有多個抗原決定基,免疫后的脾臟,約在兩月內(nèi)注射五到八次,Ag X,,,細胞融合,AgX,AgX’,ELISA,HAT,PEG Cell fusion,Hybridoma cells 融合瘤細胞,（Subcloning） (確定只有一種細胞)

11、,d’,d,abcd,abcd’,++++,+++-,X,-d,-c,-b,-a,+,-,-d,,,,,,分株培養(yǎng)篩選,篩選,單抗,傳統(tǒng)抗體 (抗血清),試驗專一性,對抗原的反應(yīng),無法分辨,完全不同,,基因工程抗體,,1 人一鼠嵌合抗體(Chimeric Antibodies),人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。,構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)

12、基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標(biāo)記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。,構(gòu)建重組表達載體,克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。 人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。,人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人

13、體內(nèi)應(yīng)用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。,2 鼠單抗可變區(qū)的人源化,盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應(yīng)。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。 CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。,經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，結(jié)合半抗原及全抗原(如細胞表面

14、受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）,人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點突變法。 全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進一步即可用于構(gòu)建和表達改形抗體。,定點突變法

15、是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。,研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進行操作。,小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。 小分子抗體有很多優(yōu)點: 可以用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低

16、; 分子小，穿透力強; 不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng); 在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。,3 小分子抗體,,,,,,,Fv,ScFv,單區(qū)抗體,最小識別單位,,,,Fab,,,,,由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 把Fab與細菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。,

17、(1)Fab,,Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,,Fv,,,ScFv,連接肽,,Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。 在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。 連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。,單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時可用

18、完全人工合成法; 在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時，可用定點突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達載體中; 如果從雜交瘤細胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_載體上。,單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌，有2種方式: 一是表達為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達細菌蛋白總量的5%-20%，但需進行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性;

19、 二是分泌型表達，將細菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細菌體外，進行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實驗室培養(yǎng)條件下每升細菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。,即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。,(3)單域抗體,VH,約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。,(4)最小

20、識別單位,,CDR,,,4 雙特異抗體和多價抗體,,雙鏈抗體 （Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。,雙特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。 即能結(jié)合靶腫瘤細胞又能結(jié)合高細胞毒性的效應(yīng)細胞,將效應(yīng)細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引

21、發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細胞,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。,Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達質(zhì)粒,目前報道的表達質(zhì)粒均為雙順反子。表達后,VLA VHB與VHA VLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。,所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細胞外,

22、還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細胞再導(dǎo)向至腫瘤細胞處,從而使效應(yīng)細胞的抗腫瘤活性增強,發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。,抗體庫技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達，然后篩選出所需的特異基因和抗體。 PCR技術(shù); 免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達; 噬菌體表面展示文庫技術(shù)。,5 抗體庫技術(shù),初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細胞中提取總RNA，反

23、轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接用總DNA為模板，用PCR技術(shù)建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達后篩選。,它是在PCR技術(shù)和Phage Display的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與P Ⅲ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進行篩選。,噬菌體抗體庫技術(shù),1990年Mc Caffert

24、y等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。,噬菌體表面展示系統(tǒng)(phage surface display system ),噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點:,外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端,將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8

25、 的先導(dǎo)系列的緊靠下游,隨機克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫,從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段,,,,用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。,使翻譯出的抗體分泌到細菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。,,篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，,,,該項技術(shù)的優(yōu)點: 將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;

26、 可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù); 抗體基因篩選的范圍廣; 技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn); 適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產(chǎn)。,噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識別一增殖過程上模擬了B細胞的成熟過程，從而在實際應(yīng)用上具有很大意義。,6 轉(zhuǎn)人Ig基因小鼠,獲取