鎘銅聯(lián)合誘導(dǎo)長江華溪蟹基因差異表達(dá)的研究.pdf

1、鎘是容易在水溶液中遷移的工業(yè)和環(huán)境化學(xué)污染物，對(duì)生物組織器官有著廣泛的毒性損傷作用，因此，研究鎘的毒性及其致毒機(jī)制具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際意義。長江華溪蟹（Sinopotamonyangtsekiens）終生棲息在淡水中，對(duì)污染物敏感性很高，是理想的環(huán)境監(jiān)測模式指示生物。mRNA差異顯示技術(shù)具有高效、簡便等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于鑒定新基因的研究，并可同時(shí)分析樣品間基因表達(dá)差異。鑒于此，本學(xué)位論文在前人研究基礎(chǔ)上，采用靜水式急性染毒后，首先利

2、用火焰原子吸收分光光度法，研究了4個(gè)鎘濃度組(CdCl2，5、0.5、0.05、0.005mg/L)、4個(gè)鎘銅聯(lián)合濃度組（CdCl2-CuSO4，5+0.1、0.5+0.1、0.05+0.1、0.005+0.1 mg/L）處理長江華溪蟹24h、48h、96h后，心臟和鰓組織中鎘和銅的積累情況。其次，根據(jù)鎘、銅在心臟和鰓組織的蓄積情況，選取24h時(shí)間點(diǎn)，采用mRNA差異顯示技術(shù)，篩選并鑒定了4個(gè)鎘濃度差異表達(dá)的序列。最后，通過綜合對(duì)比前兩

3、部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取24h、96h兩個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)，篩查了鎘(5mg/L)、鎘銅聯(lián)合(CdCl2+ CuSO4，5+0.1 mg/L)誘導(dǎo)下心臟、鰓組織中差異表達(dá)的序列，尋找鎘的應(yīng)答基因。結(jié)果如下:
　　(1)鎘誘導(dǎo)長江華溪蟹鰓組織中mRNA的差異表達(dá)
　　鎘染毒后，以2種錨定引物和12個(gè)隨機(jī)引物組成引物對(duì)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，將差異片段克隆、測序。獲得20條差異表達(dá)明顯的cDNA片段，分別在鎘誘導(dǎo)后呈高表達(dá)、低表達(dá)、特異誘導(dǎo)表

4、達(dá)、沉默表達(dá)，已測序的一個(gè)片段為未知基因序列。此片段核苷酸序列大小為661bp，具有3個(gè)開放閱讀框架，分別從193bp處到411bp處;從2bp處到160bp處;從201bp處到302bp處。推導(dǎo)氨基酸序列含157個(gè)氨基酸。
　　(2)鎘誘導(dǎo)長江華溪蟹心臟組織中mRNA的差異表達(dá)
　　鎘處理前后基因表達(dá)在數(shù)量水平和質(zhì)量水平上都存在顯著差異，數(shù)量水平的差異表現(xiàn)為鎘脅迫過程中表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)增強(qiáng)表達(dá)或減弱表達(dá);質(zhì)量水平上

5、的差異表現(xiàn)為鎘脅迫使部分ESTs特異誘導(dǎo)表達(dá)或沉默表達(dá)。12對(duì)引物組合共獲得246條擴(kuò)增條帶。其中有190條為共有條帶，占總條帶數(shù)的77.2％。差異表達(dá)的片段有56條，占總條帶數(shù)的22.7％。
　　(3)鎘、銅聯(lián)合作用對(duì)長江華溪蟹心臟和鰓組織中mRNA表達(dá)的影響
　　鎘、銅聯(lián)合作用后，鰓中銅的積累量明顯高于心臟，并且銅的積累量高于鎘。在染毒時(shí)間和濃度范圍內(nèi)，沒有檢測出心臟中鎘的積累，僅在96h下5+0.1mg/L的Cd+Cu

6、中檢出7.8μg/g。當(dāng)處理時(shí)間為96h，鰓中積累量最大為75μg/g，48h時(shí)，積累量最大為70μg/g，說明鰓在48h時(shí)積累已充分。48h，96h樣品中Cu積累值相似，心臟中為1.2μg/g，鰓中101.2μg/g。由此可見，鰓是重金屬積累的主要器官之一，并隨濃度升高重金屬的積累量增大。
　　心臟、鰓組織分別檢測到48和59條差異表達(dá)的基因片段，占可擴(kuò)增條帶的21.5％和24.7％。擴(kuò)增條帶中分別有198條和213條為共有條帶