鎘對河南華溪蟹肝胰腺組織的損傷和毒性機制研究.pdf

1、本文采用顯微技術(shù)和透射電鏡技術(shù),觀察了河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)在不同鎘濃度和處理時間下肝胰腺組織細胞的病理學變化;利用TUNEL技術(shù)、比色法、電鏡細胞化學技術(shù)、酶組織化學和激光共聚焦手段,檢測了肝胰腺組織細胞中的凋亡率,caspase-3、caspase-8、caspase-9活性,琥珀酸脫氫酶(SDH)、乳酸脫氫酶(LDH)和鈣ATP酶(Ca2+-ATPase)的活性,細胞漿和線粒體內(nèi)細胞色素c(cyt

2、 c)的含量,線粒體膜電位(Δψm)的變化;利用基因克隆、實時熒光定量PCR技術(shù)等手段,檢測了熱休克蛋白70(HSP70)和細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(CCO-Ⅰ)mRNA的表達,從機體對損傷應(yīng)答的角度探討了鎘離子對肝胰腺組織的毒性作用機制。實驗設(shè)對照組和五個鎘離子濃度組(3.56,7.12,14.25,28.49和56.98 mg/L),進行體外染毒,處理時間為24,48,72和96h。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、沛k對河南華溪蟹肝胰

3、腺組織細胞的形態(tài)學改變。肝胰腺組織發(fā)生細胞水腫、凋亡和壞死性凋亡,損傷程度隨染毒時間延長和染毒濃度增加而加重。水腫的細胞在各染毒組中均有不同程度出現(xiàn),表現(xiàn)為體積增大、胞漿淡染,嚴重時造成細胞死亡。染毒48和72 h時,光鏡下可觀察到較多的細胞凋亡,而在56.98 mg/L濃度組出現(xiàn)明顯的細胞連續(xù)性中斷、壞死及血淋巴細胞浸潤。凋亡的細胞體積變小,胞漿嗜酸性增強,細胞核固縮、深染。同時,透射電鏡觀察到典型的凋亡小體:細胞核皺縮,染色質(zhì)凝集在

4、核膜下,胞漿中各細胞器基本消失,只留有少許線粒體。細胞核和線粒體出現(xiàn)明顯損傷,線粒體腫脹、膜破裂、嵴變短變少,甚至消失,線粒體呈雙層膜囊泡狀改變。溶酶體數(shù)量增多,出現(xiàn)較多巨大的吞噬大量自身成份的自噬溶酶體。細胞衣和P/Ca顆粒隨染毒濃度增加而逐漸消失。高鎘濃度組中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改變。
　?、奇k誘導河南華溪蟹肝胰腺組織出現(xiàn)細胞凋亡與線粒體損傷：鎘染毒24h,隨著濃度的增加凋亡指數(shù)明顯增高,SDH、Δψm、線粒體

5、內(nèi)cyt c含量、Ca2+-ATPase活性逐漸增加。SDH與Δψm、線粒體內(nèi)cyt c,Δψm與線粒體內(nèi)cyt c含量,Ca2+-ATPase與Δψm之間有正相關(guān)關(guān)系。但是胞漿中cyt c含量無明顯變化(p>0.05)；鎘染毒48 h,AI顯著增加(p<0.05)。caspase-3、caspase-9、SDH活性、線粒體內(nèi)cyt c含量、Δψm、Ca2+-ATPase活性隨鎘濃度的增加而顯著增加(p<0.05),并在最高濃度組達到最

6、大。caspase-3與caspase-9,caspase-3與AI、SDH的活性,線粒體內(nèi)cyt c含量與Δψm,Δψm與SDH,SDH與Ca2+-ATPase,Ca2+-ATPase與線粒體內(nèi)cyt c含量之間有正相關(guān)關(guān)系。胞漿中cyt c含量無明顯變化(p>0.05)；鎘染毒72 h,AI顯著增加(p<0.05)。caspase-3、caspase-9、SDH活性、Δψm、Ca2+-ATPase活性伴隨染毒濃度的增加先增后降。電鏡

7、細胞化學技術(shù)顯示,SDH主要位于線粒體嵴上,隨染毒濃度增加其活性先增后降。線粒體內(nèi)cyt c含量在56.98 mg/L組顯著降低(p<0.05)。caspase-3和caspase-9的活力在3.56、7.12和14.25 mg/L濃度組顯著增高(p<0.05),之后活性逐漸降低到對照組水平,二者之間存在正相關(guān)關(guān)系。但是,它們與AI沒有相關(guān)性(p>0.05)。caspase-3、caspase-9與SDH,SDH與Δψm、Ca2+-AT

8、Pase之間存在正相關(guān)關(guān)系。Δψm在7.12 mg/L組顯著性最高(p<0.05),而在56.98 mg/L組顯著性最低(p<0.05)。此時,AI從28.49 mg/L組的23％驟增到56.98 mg/L組的32.9%,Ca2+-ATPase在3.56、7.12和14.25 mg/L組顯著增加(p<0.05)。Δψm與Ca2+-ATPase、線粒體cyt c含量之間有正相關(guān)關(guān)系?？墒?胞漿中cyt c含量雖然沒有明顯變化(p>0.05

9、),但是隨著濃度的增高有增多的趨勢；鎘染毒96 h,SDH活性、Δψm、線粒體內(nèi)cyt c含量、Ca2+-ATPase活性隨染毒濃度增加先增后降,且均在56.98 mg/L組受到顯著抑制(p<0.05)。隨鎘濃度增加,AI顯著增加(p<0.05),從28.49 mg/L組的45.5%驟增到56.98 mg/L組的64.4%。SDH與Δψm、線粒體內(nèi)cyt c、Ca2+-ATPase活性,線粒體內(nèi)cyt c含量與Δψm、Ca2+-ATPa

10、se活性,Δψm與Ca2+-ATPase活性之間有正相關(guān)關(guān)系。胞漿中cyt c含量在7.12和56.98 mg/L組顯著性增加(p<0.05),并且cyt c在胞漿和線粒體中的含量有負相關(guān)關(guān)系。
　?、强寺〕龊幽先A溪蟹肝胰腺組織中HSP70和CCO-Ⅰ的部分基因序列。鎘暴露72 h時,HSP70和CCO-ⅠmRNA的表達在各染毒組中無顯著性變化(p>0.05),但是表達有先增高后降低的趨勢。HSP70 mRNA的表達在14.25

11、mg/L組達到最高,為對照組的2.36倍,在56.98 mg/L組降到與對照組一致。CCO-ⅠmRNA的表達在7.12 mg/L組達到最高,為對照組的1.7倍,而在56.98 mg/L組僅為對照組的0.53倍。
　?、葘嶒灲Y(jié)果表明：①河南華溪蟹暴露于鎘,肝胰腺組織出現(xiàn)不同程度的損傷,其中線粒體和細胞核的損傷最為明顯。高濃度和長時間鎘作用后,由于除了線粒體和細胞核的損傷之外,其他細胞器也受到嚴重損傷,因此引起肝胰腺組織細胞的蛋白合成

12、、組裝、轉(zhuǎn)運等生理過程受阻,肝胰腺發(fā)生嚴重功能損傷,最終將導致蟹體死亡。②雖然線粒體最初受到損傷,但是作為整體動物實驗,溪蟹可調(diào)動機體的各種代償機制來對抗鎘的毒性。因此,正常的或損傷輕的細胞、線粒體代償性做功增加,表現(xiàn)為SDH活性、線粒體膜電位、細胞色素c含量增加等。當更多的、損傷重的線粒體出現(xiàn)后,將引起細胞能量衰竭,SDH活性、線粒體膜電位、Ca2+-ATPase活性受到抑制,導致細胞死亡。③鎘染毒48 h時,鎘對肝胰腺細胞的損傷以誘

13、導細胞凋亡為主,并且細胞凋亡的發(fā)生是通過線粒體的caspase-dependent通路實現(xiàn)的。在暴露72 h后,不能排除caspase-independent通路的參與。無論是哪種通路誘導的細胞凋亡,凋亡的發(fā)生一方面使得出現(xiàn)不可逆損傷的細胞通過對機體損傷最輕微的方式被清除掉,另一方面這種過多的細胞死亡也會影響組織器官的功能。④HSP70基因的不表達,使鎘可以從基因水平上抑制肝胰腺組織的防御功能;CCO-Ⅰ基因的不表達,導致CCO耗竭或活