氯化鎘誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞不同階段差異表達(dá)基因篩選的研究.pdf

1、1.目的：
　　鎘(Cadmium，Cd)是一種毒性很強(qiáng)的重金屬，是環(huán)境污染物和致癌物，人類可通過工業(yè)污染或受污染的食物和水源廣泛接觸到鎘。鎘及其化合物被機(jī)體吸收后，自然代謝緩慢，大量研究證實(shí)鎘及其化合物可通過生物放大和生物累積作用，誘發(fā)人體多種組織器官損傷，甚至導(dǎo)致惡變。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）早在1993年就將其歸類為第一類致癌物，但其致癌機(jī)制還不完全清楚。
　　癌變是一個(gè)復(fù)雜的多階段的過程，內(nèi)外環(huán)境因素的相互作用導(dǎo)

2、致了多種基因的變化，這些基因的改變往往與環(huán)境致癌因素的長期累積性損傷作用和機(jī)體內(nèi)遺傳因素有關(guān)。近年來，有多項(xiàng)研究針對鎘對機(jī)體毒作用和致癌性展開。鎘致癌的機(jī)制和過程就成為了研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，有研究表明細(xì)胞基因表達(dá)的改變是鎘對機(jī)體損傷、鎘致癌的機(jī)制之一。為了更深入的探討鎘致癌的過程和機(jī)制，本課題對鎘染毒不同階段的細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和檢測，分析其在鎘染毒過程中的不同階段基因表達(dá)的改變，從基因表達(dá)角度揭示鎘致癌機(jī)制。
　　2.方法：
　

3、　2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代鎘惡性轉(zhuǎn)化人支氣管上皮模型已于前期研究建立并公開發(fā)表。將正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化第30代細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種裸鼠成瘤細(xì)胞從液氮罐中取出，置37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。隔日換液，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底時(shí)，制成濃度為1×106細(xì)胞懸液，備用。
　　2.2樣本的準(zhǔn)備、測序文庫的構(gòu)建按試劑盒要求提取樣本的RNA，純化和濃縮，得到mRNA。將mRNA打斷成200bp左右的片段，以小片段mRNA為模

4、板，用隨機(jī)引物合成雙鏈cDNA。將cDNA擴(kuò)增，經(jīng)過末端修，產(chǎn)物純化后，在3’末端加上“A”堿基，適配子(adapter)連接，純化后，產(chǎn)物擴(kuò)增。
　　2.3進(jìn)行高通量測序、對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理通過測序，得到原始數(shù)據(jù)(Raw reads),經(jīng)質(zhì)量控制，取出雜質(zhì)數(shù)據(jù)得到校準(zhǔn)數(shù)據(jù)（Clean reads）。對校準(zhǔn)數(shù)據(jù)做質(zhì)量評估，質(zhì)量合格后才可進(jìn)行下一步分析。
　　2.4測序數(shù)據(jù)的結(jié)果分析過濾后得到的Clean reads通過與參考

5、序列進(jìn)行比對，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對各組基因表達(dá)水平、差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，分析實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析和Pathway分析。
　　3.結(jié)果：
　　3.1從正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，氯化鎘轉(zhuǎn)化第30代細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種裸鼠成瘤細(xì)胞中提取的總 RNA在核算定量儀上進(jìn)行檢測，總 RNA濃度為2～3mg/ml,OD260nm/OD280nm值在1.9～2.0之間。總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外線下觀察到2

6、8S和18S兩條條帶，28S的亮度約為18S的1.5～2倍，5S條帶未見或隱約可見。結(jié)果表明提取的總RNA純度較高，未降解。三個(gè)樣本mRNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示均為一條 smear，主要集中在0.5-2.0 kb之間，完整性良好。
　　3.2三個(gè)樣品原始數(shù)據(jù)的堿基含量及分布，由于受隨機(jī)引物的偏好性影響，數(shù)據(jù)的前l(fā)O個(gè)堿基含量波動(dòng)較大，之后的較好。三種細(xì)胞堿基質(zhì)量均良好，校準(zhǔn)讀數(shù)占原始讀數(shù)的98﹪以上，校準(zhǔn)后的數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。

7、
　　3.3對樣品的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)與參考序列的比對，三個(gè)樣品的一致率均在60％左右，表明從實(shí)驗(yàn)建庫到測序等步驟質(zhì)量均符合要求。樣本序列測序飽和度良好，說明測序過程狀態(tài)較好。對樣品的測序隨機(jī)性進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)樣品reads在參考基因上的分布較為均勻。
　　以正常16HBE細(xì)胞為對照組，Cdcl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表達(dá)基因有1926個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，有457個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)；Cdcl2誘導(dǎo)成瘤細(xì)胞則有842個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，有122

8、個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)。
　　通過GO功能分類注釋得出，在細(xì)胞組成方面，細(xì)胞內(nèi)受體、細(xì)胞器、細(xì)胞核、染色體和蛋白質(zhì)復(fù)合體的功能；在分子功能方面，分子粘合物、蛋白結(jié)合物、核苷酸結(jié)合物、激酶活性和轉(zhuǎn)移酶活性功能；在生物學(xué)過程中，細(xì)胞過程、組織或細(xì)胞生物成分轉(zhuǎn)化、核分裂、姐妹染色單體分離和染色體分離等功能的基因差異表達(dá)情況，均隨著鎘誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的程度而加深。
　　通過Pathway分析，可以看出相對于正常16HBE細(xì)胞，Cdcl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

9、細(xì)胞和Cdcl2誘導(dǎo)成瘤細(xì)胞在細(xì)胞周期、氧化磷酸化、腫瘤通路、小細(xì)胞肺癌和DNA復(fù)制等方面功能的基因有顯著性改變。隨著鎘誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的程度，至細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和腫瘤形成通路這三項(xiàng)功能的基因差異表達(dá)程度逐漸加深。其中，腫瘤原癌基因CBL、MET的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因CCND1、CCNA2表達(dá)上調(diào)，螺旋體保存激酶CHUK、泛素蛋白連接酶同系物MDM2、、磷脂酶C PLCG1基因表達(dá)上調(diào)。
　　4.結(jié)論：
　　4.1成功

10、構(gòu)建了正常16HBE細(xì)胞、Cdcl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、Cdcl2誘導(dǎo)成瘤細(xì)胞的測序文庫。通過高通量數(shù)字基因表達(dá)譜測序，得到了三個(gè)樣本的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，Cdcl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和Cdcl2誘導(dǎo)成瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因的篩選提供了依據(jù)。
　　4.2對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，了解在鎘毒作用的不同階段，基因差異表達(dá)量是隨著染毒時(shí)間延長而增加的。GO功能分析，掌握兩組樣本細(xì)胞組成、分子功能、生物學(xué)過程方面有基因表達(dá)差異。Pathway分析得知，隨著鎘染毒時(shí)