血小板血型的檢測(cè)

1、復(fù)習(xí),血小板血型抗原 血小板相關(guān)抗原：ABO、HLA 血小板特異性抗原HPA,血小板血型的臨床意義,血小板上HLA抗原的同種免疫血小板上ABO血型抗原的同種免疫血小板上HPA抗原的同種免疫血小板上ABH,HLA,HPA抗原均可引起免疫反應(yīng);免疫反應(yīng)程度不一;免疫反應(yīng)強(qiáng)弱程度的影響因素尚不清楚,血小板血型抗體,血小板抗體也可以分為兩類 一類主要是針對(duì)人類組織相容性抗原(HLA)I類抗原的抗體，即血小板相關(guān)抗體

2、（PAIgG） 一類是針對(duì)GP抗原(血小板膜糖蛋白，攜帶HPA分子）的血小板特異性抗體，稱為PBIgG,兩次或以上血小板輸注無效且無明顯非免疫因素導(dǎo)致↓檢測(cè)患者血清中是否存在HLA抗體血清中存在HLA抗體 血清中不存在HLA抗體↓ ↓HLA相符的血小板輸注

3、 進(jìn)一步分析非免疫因素 ↓ ↓ ↓ ↓效果良好 效果不好 是 不是↓ ↓ ↓ ↓ 繼續(xù) 考慮1、HLA不合

4、 治療病因 HPA抗體檢測(cè) 2、非免疫因素 根據(jù)臨床實(shí)際情況 ↓ ↓ 3、HPA 選擇是否繼續(xù)進(jìn)行 陽性 陰性 4、ABO 血小板輸注 ↓ ↓

5、 HPA相符 HLA相符,二者區(qū)別同種異體免疫 輸入的血小板很快破壞，輸注后1小時(shí) 和24小時(shí)均不見計(jì)數(shù)增高非免疫因素 輸注后1小時(shí)血小板計(jì)數(shù)增高，但24小時(shí)計(jì)數(shù)不增高或

6、受影響,臨床上由于血小板血型抗原引起的血小板減少癥主要有5種：血小板輸注無效（PTR）輸血后紫癜（PTP）新生兒同種免疫血小板減少癥（FMAIT/NAIT）被動(dòng)免疫血小板減少癥（PAT）移植相關(guān)的同種免疫血小板減少癥（TAT),二、輸血后紫癜,輸血后血小板減少性紫癜(post-transfusion thrombocytopenic purpura，PTTP)，又稱“輸血后紫癜”, Post-transfusion purp

7、ura, PTP: 由于血小板輸注后發(fā)生同種免疫反應(yīng)所致，一般發(fā)病率低?；颊弑惠斎氩幌嗳莸难“?全血或多次妊娠而產(chǎn)生血小板抗體，破壞輸入的和自身血小板而導(dǎo)致急性和暫時(shí)性血小板減少。患者多見于（95%)有多次妊娠或輸血史的老年女性。,PTP的病因尚未明確，有數(shù)種假說。 抗體致敏形成的血小板抗原抗體復(fù)合物與自身正常血小板結(jié)合導(dǎo)致血小板破壞 可溶性血小板吸附于正常血小板上，與血小板抗體反應(yīng)后導(dǎo)致血小板的破壞 血小板抗體與自身

8、和外源性血小板交叉反應(yīng),HPA-1a是引起該病的主要抗原。我國(guó)絕大部分人為HPA-1a抗原陽性。實(shí)驗(yàn)室檢查：血小板計(jì)數(shù)降低、骨髓巨核細(xì)胞增生活躍、血清學(xué)檢查血小板抗體存在但效價(jià)和病情無關(guān)。,臨床表現(xiàn),輸入含血小板的血液制品后7～10天發(fā)病。有明顯的免疫反應(yīng)癥狀，如畏寒、寒戰(zhàn)、高熱、蕁麻疹，重者有頭痛、胸痛、呼吸困難甚至休克。繼而血小板明顯急性減少，有不同程度的出血表現(xiàn)，皮膚淤點(diǎn)、淤斑，口腔、鼻腔出血，舌黏膜出現(xiàn)血皰，重者可以有血尿、消

9、化道出血或陰道出血；患者體內(nèi)可檢出高效價(jià)的血小板特異性抗體并存著自身血小板的破壞，當(dāng)血小板計(jì)數(shù)低于10X109/L時(shí)，會(huì)出現(xiàn)皮下或刀口出血，如不及時(shí)處理患者可能死亡，死亡率大約在 5%-10%。,本病輸血小板無效，甚至有加重病情的危險(xiǎn)，腎上腺皮質(zhì)激素不能縮短病程，但是，有可能改善出血癥狀。主要治療措施為血漿置換或換血，換血漿優(yōu)于換全血。在輸血后血小板顯著減少和發(fā)生嚴(yán)重出血癥狀時(shí)，應(yīng)立刻做血漿置換，一次交換65%～85%的血漿量，平均

10、在1～5天后出血癥狀減退，血小板數(shù)目上升。盡可能避免或減少輸注血小板及含血小板的血液制品。,大多數(shù)PTP為針對(duì)HPA—la的同種抗體所致2002年英國(guó)報(bào)道了第2例表現(xiàn)為抗HPA一5a相關(guān)PTP。6l歲女性診斷為急性心肌梗塞伴胃腸道出血，在接受6單位壓積紅細(xì)胞5天后，由于HPA一5a抗體發(fā)展成PTP，表現(xiàn)為嚴(yán)重的血小板減少癥(5000／UL)。采用靜脈內(nèi)注射免疫球蛋治療很成功，提示無論患者發(fā)病為何種抗體，這種治療方法對(duì)于PTP患者的治

11、療是高度有效,三、新生兒同種免疫血小板減少癥(FMAIT/NAIT),Neonatal alloimmune thrombocytopenia, NAIT foetal maternal alloimmune thrombocytopenia, FMAIT發(fā)病機(jī)制:,胎兒血小板↓懷孕或生產(chǎn)時(shí)進(jìn)入母體循環(huán)↓胎兒血小板刺激母體產(chǎn)生抗體↓母親IgG抗體通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)使胎兒血小板致敏↓血小板破壞增加↓發(fā)生FAI

12、T,第一胎即可發(fā)?。徊∷缆始s13%；治療：輸入相合的血小板以提高患兒的血小板數(shù)，如找不到相合的血小板，可以輸注經(jīng)洗滌和輻射的母親血小板，也可給患兒做放血治療；治療前交叉配血：以母親血清與供者血小板進(jìn)行交叉配合試驗(yàn)；預(yù)防：母親在孕期可進(jìn)行血漿置換。,病例介紹：,患兒，女性，1994年6月3日生 足月順產(chǎn)，出生體重3.1kg，身高49cm，一般情況尚好，無血管瘤，無肝脾腫大，軀體可見廣泛的紫癜。外周血血小板計(jì)數(shù)為4．0×1

13、09，紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常；腹部超聲檢查未見血管瘤和其它異常，腦超聲檢查示出血可能。以輸注同型血小板(隨機(jī)供者)和高劑量免疫球蛋白治療(每24小時(shí)1g／kg)，病情得到控制 6月12日出院，出院時(shí)血小板計(jì)數(shù)為154×109／L。,患兒母親．28歲。第1胎第1產(chǎn)，身體健康，血小板計(jì)數(shù)為226×109／I ，無不良嗜好．乙型肝炎病毒(HBV)檢測(cè)陰性．從來接受過輸血或其它血制品治療．懷孕期間無毒物接觸史。,四、

14、被動(dòng)免疫血小板減少癥,Passive alloimmune thrombocytopenia, PAT: 患者輸入含有血小板特異性抗體的血漿，在數(shù)個(gè)小時(shí)之內(nèi)出現(xiàn)血小板減少癥，約一周后緩解。一旦發(fā)現(xiàn)獻(xiàn)血員血漿、血清中含有血小板特異性抗體應(yīng)立即停止獻(xiàn)血，這類獻(xiàn)血員多為有妊娠史。,一例因輸全血導(dǎo)致的被動(dòng)免疫血小板減少癥,患兒男，6歲。因畏寒、發(fā)熱、食欲不振1周^院。體檢：T39℃ ，P82次／分，心肺正常，肝脾無腫大。輔助檢查：PLTl47

15、×109／L，Hb89g/L，RBC3．43×109／L，血肥達(dá)氏反應(yīng)01：160，H1：320．傷寒LPS—PHA試驗(yàn)陽性(1：640)：骨髓常規(guī)提示感染。診斷：傷寒。予先鋒霉素靜脈滴注及對(duì)癥處理。,因患兒有中度營(yíng)養(yǎng)不良．在體溫正常后第6天輸同型鮮血100ml，輸血10分鐘后出現(xiàn)畏寒、寒故，肌注非那更15mg緩解。次晨患兒全身皮膚廣泛出血點(diǎn)，臂部、前胸、腋下大片瘀斑，查PLT為32×109／L，8小時(shí)后降

16、至12×109／1 ，血Hbl03g／L．RBC4.0×109／L，PT、KPTT正常，尿潛血、尿三膽、尿FDP均陰性。予地塞米松4rng／d及vit C靜脈滴注1O天，紫癜隱退，plt回升至135×109／L(血小板動(dòng)態(tài)變化見圖)。,移植相關(guān)的同種免疫血小板減少癥,Transplantation-associated alloimmune thrombocytopenia, TAT: 移植后因血小

17、板抗原引起的血小板減少癥；該病較罕見。 官接受者的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗外來移植物（血小板）的特異性抗體；或供體器官中殘留的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗宿主血小板的抗體 免疫球蛋白療法和脾切除法能使血小板計(jì)數(shù)正常化。,血小板自身免疫作用,血小板自身免疫作用可產(chǎn)生特發(fā)性血小板減少性紫癜（Idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP).自身免疫性疾病，患者體內(nèi)存在抗自己血小板的特異性抗體導(dǎo)致血液中血小板減少，為臨床最

18、常見的免疫性血小板減少癥。抗體多為IgG、IgA，少數(shù)病人為IgM抗體。抗體的Fab片段和血小板膜糖蛋白結(jié)合后使得血小板抗體復(fù)合物經(jīng)單核吞噬系統(tǒng)（由Fc段和其受體結(jié)合）被吞噬破壞。,本病以皮膚粘膜下及其他部位出血為主要表現(xiàn)。      1.急性型。多見于兒童，發(fā)病前l(fā)－3周常有上呼吸道及其他病毒感染史。起病急，出血嚴(yán)重。突發(fā)廣泛的皮膚粘膜血點(diǎn)或成片瘀斑。甚至皮下血腫。常伴

19、有鼻衄、牙齦出血等。胃腸和泌尿道出血可見便血及尿血。偶見結(jié)膜下、視網(wǎng)膜出血。少數(shù)患者同時(shí)伴有內(nèi)臟或顱內(nèi)出血而出現(xiàn)嚴(yán)重的不良后果。    2.慢性型。多見于成人，病程為６個(gè)月以上。起病緩。出血癥狀輕，一般僅見皮膚瘀點(diǎn)或瘀斑反復(fù)發(fā)作性出現(xiàn)，或常見鼻衄、齒齦出血、結(jié)膜出血等其他出血傾向。女性患者可以月經(jīng)過多或子宮出血為主要表現(xiàn)。長(zhǎng)期反復(fù)大量出血而引起貧血者，可出現(xiàn)低熱、乏力、頭昏、失眠及脾腫大等,至

20、今未能證明ITP相關(guān)自身抗體的特異性。有研究表明，ITP相關(guān)抗體有些是自身隱蔽抗原的抗體。速發(fā)型ITP多見于感染后兒童，癥狀多樣，超過90%的病例預(yù)后良好，死亡率＜1%。慢性ITP多由于淋巴組織增生、占位性腫瘤及其他自身免疫疾病。其預(yù)后基于出血程度。,藥物所致血小板抗體及疾病,1929年證明了奎寧引起血小板減少癥；1953年證明了奎寧引起的血小板減少癥患者血清中存在該藥引起的抗體,抗體、藥品、血小板反應(yīng)的機(jī)制：機(jī)制未完全清楚藥

21、品作為一種半抗原和血小板膜形成復(fù)合物，產(chǎn)生的抗體識(shí)別該復(fù)合物進(jìn)而使血小板破壞；血小板膜上的奎寧引起血小板膜隱蔽的抗原暴露，形成新的血小板抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體導(dǎo)致血小板破壞,血小板血型的檢測(cè),血小板血型檢測(cè),抗體的篩選和鑒定交叉配血血型鑒定,血小板抗體檢查,正確檢測(cè)出血清中血小板抗體及其特異性對(duì)獲得有效的血小板輸注是至管重要的。目前的檢測(cè)方法多種： 免疫熒光、ELISA、SPISA、Micro-column gel、SEPSA等

22、。,1、血小板黏附免疫熒光試驗(yàn)Platelet adherence immunofluorescence test PAIFT,原理為用已知血小板黏附于一種特殊的玻璃孔中，和被檢血清反應(yīng)后洗凈，使用熒光素標(biāo)記的兔抗人IgG免疫球蛋白避光靜置后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。該方法為早期的檢測(cè)血小板抗體的敏感方法，1986年國(guó)際血小板血清學(xué)會(huì)將其作為標(biāo)準(zhǔn)的參考方法，并規(guī)定任何新方法應(yīng)和其進(jìn)行比較。,2、簡(jiǎn)易致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)試驗(yàn)SEPSA

23、,原理：在微孔板上進(jìn)行，血小板固定在孔壁上，與被檢血清反應(yīng)后以抗IgG指示細(xì)胞反應(yīng)得到結(jié)果如果血小板上無抗體 ，則指示細(xì)胞聚集在孔底 ，形成細(xì)胞扣 ，為陰性結(jié)果，反之則為陽性。,該方法檢測(cè)的是所有血小板相關(guān)抗體,包括特異性血小板抗體和HLA 抗體, 適用于廣泛的血小板抗體篩查血小板附著在固相中，造成部分特異性抗原決定簇丟失現(xiàn)象。利用磷酸氯喹溶液處理血小板, 除去血小板表面的HLA 抗原, 對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化。耗時(shí)較長(zhǎng), 靈敏性差,

24、 目前已很少采用。,3、修飾的抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試試驗(yàn)（Modified antige capture ELISA,MACE）,1 洗滌PLT,制備50%PLT懸液.2 PLT與患者血清或血漿在管內(nèi)發(fā)生反應(yīng),若有相應(yīng)抗體,則結(jié)合到PLT上形成復(fù)合分子.3 洗滌去掉其中未結(jié)合的Ig.4 裂解PLT,游離出抗原-抗體復(fù)合分子.5 加裂解液到相應(yīng)的微孔內(nèi),孔壁上包被的抗體可結(jié)合(抓獲)其中的抗原或抗原-抗體復(fù)合分子.6

25、 洗滌,去掉未結(jié)合的Ig.7 加酶標(biāo)二抗(anti-Ig),結(jié)合到抗原-抗體復(fù)合分子上,形成一條反應(yīng)鏈;病人血液中無相應(yīng)的抗體,則反應(yīng)鏈不成立.8 洗滌去掉未結(jié)合的二抗.9 加底物顯色.10 終止反應(yīng),測(cè)OD值,判斷結(jié)果.,ELISA for Platelet Antibody Detection,單克隆抗體固著血小板抗原分析McAb immobilization of platelet antigen,MAIPA原理類

26、似于MACE，但更復(fù)雜。 同MACE一樣,由于血清中抗體是與完整的血小板細(xì)胞反應(yīng),而不是附著在固相中, 避免了部分特異性抗原決定簇丟失現(xiàn)象發(fā)生,因此,MACE和MAIPA較固相吸附實(shí)驗(yàn)更有優(yōu)勢(shì).,實(shí)驗(yàn)過程,血小板與血清孵育、離心、洗滌再與鼠抗血小板單克隆抗體孵育，離心洗滌后，加入裂解液使血小板裂解將裂解的血小板加入已包被了羊抗鼠IgG的多孔板包被羊抗鼠IgG的多孔板俘獲單抗加入酶標(biāo)的羊抗人IgG,MAIPA原理：洗滌過的完整

27、的血小板與人血清孵育(以HPA-1a抗體為例)，單克隆抗體與與相應(yīng)糖蛋白結(jié)合（以GPIIb/IIIa為例）。裂解血小板，將上清加入先前包被抗鼠的IgG，用過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG檢測(cè)結(jié)合在糖蛋白上的人抗體，用合適的顯色劑顯色。,優(yōu)點(diǎn)：避免血小板附著在固相中造成的部分特異性抗原決定簇丟失現(xiàn)象?？蓹z測(cè)血小板抗原。缺點(diǎn)：如果被檢血清中抗血小板抗體與鼠單克隆抗體識(shí)別同一抗原決定簇，它們將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，即可出現(xiàn)假陰性反應(yīng),MAIPA 法由于檢

28、測(cè)血小板相關(guān)抗體特異性強(qiáng), 尤其可以區(qū)分多種抗體, 被認(rèn)為是檢測(cè)血小板抗體的金標(biāo)準(zhǔn)； 但其操作步驟繁瑣, 耗時(shí)長(zhǎng), 技術(shù)要求高, 只在少數(shù)參比實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用,Flow cytometry流式細(xì)胞儀檢測(cè),應(yīng)用流式細(xì)胞儀免疫熒光技術(shù)檢測(cè)血小板抗原抗體反應(yīng)結(jié)果更為準(zhǔn)確，可以定量檢測(cè)。完整的血小板與患者血清孵育，洗滌，加入熒光標(biāo)記的抗人球蛋白試劑，以檢測(cè)血小板是否結(jié)合了特異性血小板抗體。缺點(diǎn)：流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)相對(duì)費(fèi)用仍較昂貴，不能在臨

29、床廣泛推廣。在血小板嚴(yán)重減少時(shí)，測(cè)定區(qū)中非血小板成分有所增加，針對(duì)淋巴細(xì)胞的IgG可被誤認(rèn)為PAIgG，血液中的細(xì)胞碎片對(duì)試驗(yàn)有干擾。,微柱凝膠間接免疫分析技術(shù)Microcolumn gel immunoassay,MGIA,MGIA原理：微柱凝膠中依次加入受檢者血清、血小板和指示紅細(xì)胞．指示紅細(xì)胞上包被有動(dòng)物抗人血小板抗體，該抗體 Fc段結(jié)合在人紅細(xì)胞膜上，F(xiàn)ab段與血小板結(jié)合，如果受檢者血清中存在抗血小板抗體，該抗體 Fab段亦與

30、血小板結(jié)合 ，相鄰 的抗體 Fc段通過抗人球蛋白搭橋連接成網(wǎng)絡(luò)狀凝集復(fù)合物，通過離心，該復(fù)合物浮于凝膠表面或位于膠中為陽性，如果受檢者血清中無血小板抗體，則不能形成網(wǎng)絡(luò)狀血凝復(fù)合物 ，指示紅細(xì)胞沉于微柱凝膠管尖底部為陰性；,結(jié)果判讀模式,血小板血型檢測(cè)血清學(xué)方法評(píng)價(jià),血清學(xué)方法從實(shí)驗(yàn)原理分析，多采用從富血小板血漿中提取血小板來包被反應(yīng)板，進(jìn)一步用直接法或間接法檢測(cè)相應(yīng)抗體，特異性和 (或)敏感度不高文獻(xiàn)報(bào)道，MAIPA法的特異度為85

31、％ ，但敏感度僅為47％ ，且耗時(shí)耗力。SEPSA方法的敏感度僅為39．4％ ，至少需要血小板1 X 107。,血小板在制備過程中部分活化產(chǎn)生脫顆粒作用，抗原結(jié)構(gòu)的主要成分發(fā)生相應(yīng)構(gòu)象改變，造成抗體檢出率降低;血小板本身的聚集而產(chǎn)生不均勻包被的情況，抗體在微板反應(yīng)孔的表面上有非特異性吸附，使背景信號(hào)加強(qiáng)，導(dǎo)致結(jié)果判讀陰性本底增高，假陰性增多單克隆抗體的覆蓋面窄，抗原的檢出受到限制血清Ig非特異性吸附于血小板靶抗原是該類試驗(yàn)的共同問

32、題。,血小板交叉配血：,檢測(cè)受者血清中是否存在針對(duì)供者血小板的抗體，或供者血清中是否存在受者血小板抗原相應(yīng)的抗體，同紅細(xì)胞交叉配血一樣，前者為主側(cè)交叉，后者為次側(cè)交叉。,血小板交叉配血：一般可以采用SEPSA、和MGIA法進(jìn)行血小板交叉配血試驗(yàn)，以避免由于血小板抗體或HLA相關(guān)抗體所致的血小板輸血反應(yīng)或輸注無效。,血小板抗體檢測(cè)和血小板交叉配型試劑盒（固相凝集法）,檢驗(yàn)原理：反應(yīng)板中包被有血小板鼠單克隆抗體（針對(duì)血小板表面糖蛋白II

33、b/IIIa,Ib/V/IX），血小板經(jīng)離心洗滌后可在反應(yīng)板中形成血小板單層。加入待檢血清，在板中經(jīng)過孵育后，若該血清中不含有血小板抗體則經(jīng)過洗滌被去除；若含有血小板抗體，則該抗體與反應(yīng)板中的血小板結(jié)合，加入抗人IgG及人IgG致敏紅細(xì)胞（指示細(xì)胞）經(jīng)離心后指示細(xì)胞結(jié)合到血小板單層上。因此陽性反應(yīng)為指示細(xì)胞均勻鋪在反應(yīng)孔底部，而陰性反應(yīng)為指示細(xì)胞在反應(yīng)孔底部中間形成紅細(xì)胞聚集。,主要組成成份1、反應(yīng)板………………………8孔×

34、12        2、低離子介質(zhì)………………10ml×13、指示細(xì)胞……………………6ml×1          4、抗人IgG ……………………6ml×15、陰性對(duì)照……………………1ml×1  &#

35、160;       6、陽性對(duì)照…………………  1ml×17、30×濃縮洗滌液……………10ml×1,產(chǎn)品特點(diǎn)1、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，時(shí)間短，結(jié)果可靠，易于判讀；2、抗人IgG為多克隆抗體，敏感性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高；3、可用于大量樣本的檢測(cè)，重復(fù)性好；4、對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單，適用于血站、醫(yī)院、實(shí)驗(yàn)室,與HLA配合試驗(yàn)相比，交叉配血

36、方法更經(jīng)濟(jì)和方便；能夠避免HLA血型不配合，但是相容的血小板；但當(dāng)患者血清對(duì)超過70%的獻(xiàn)血者血小板反應(yīng)時(shí)，也只能用HLA配合試驗(yàn)；首先檢測(cè)這些反應(yīng)是否血小板抗體所致，如果是，則應(yīng)學(xué)則已知血小板血型的供者或在親屬中選擇合適的血小板供者。為避免輸血相關(guān)的移植物抗宿主病，可先將親屬血小板輻射后使用。,血小板抗原檢測(cè),血清學(xué)方法分子生物學(xué)方法,血清學(xué)HPA分型價(jià)值有限因?yàn)閺难“鍦p少癥的患者中僅能獲得極為少量的血小板而且除HPA-

37、1a和HPA-5b之外，可靠的HPA血清學(xué)分型試劑很少；HPA抗血清中常常含有HLA-I類抗體，將它們用于GP特異性試驗(yàn)，如血小板抗原的單克隆抗體固定試驗(yàn)（MAIPA）具有局限性。單克隆抗體雖現(xiàn)已常規(guī)用于紅細(xì)胞表型分型試驗(yàn)，但除了HPA-1a之外，還沒有一種單克隆抗體用于HPA分型。然而，最近發(fā)表了關(guān)于使用多克隆抗體或重組抗HPA-1a進(jìn)行快速篩選試驗(yàn)的幾種方法。這些表型分型試驗(yàn)可互補(bǔ)基因分型試驗(yàn)以備HPA配選供者之用。,相反，HP

38、A基因分型能夠從任何合適的細(xì)胞中獲取基因組DNA而實(shí)現(xiàn)，而且可以使用商業(yè)試劑盒。22個(gè)血小板特異性抗原的分子基礎(chǔ)已確定，并且其中的21個(gè)被證實(shí)是SNP。已有許多技術(shù)用于SNP分型，其中幾種已用于HPA基因分型，盡管僅有幾項(xiàng)得到廣泛應(yīng)用。PCR序列特異性引物分析（PCR－SSP），由于其簡(jiǎn)單易行而被許多實(shí)驗(yàn)室所采用，在同樣的PCR條件下能夠檢測(cè)多種HPA基因型的操作程序已有報(bào)道。,血小板抗原基因檢測(cè),血小板抗原多態(tài)性源于編碼基因的單個(gè)核苷

39、酸置換，為血小板抗原基因檢測(cè)創(chuàng)造了良好的條件。正好也補(bǔ)充了血小板檢測(cè)免疫血清學(xué)手段不足的缺陷。除HPA14bw外，其他HPA基因都表現(xiàn)出單核苷酸多態(tài)性，因此，檢測(cè)SNP的方法適用于HPA檢測(cè)基因分型檢測(cè)不要特異性的血清抗體。,PCR-SSP：PCR序列特異性引物技術(shù)(PCR．SSP)，此技術(shù)采用序列特異性引物(SSP)，SSP的3端具有獨(dú)一無二的序列，在退火時(shí)只能與某特定等位基因結(jié)合，因此能夠特異性地?cái)U(kuò)增HPA基因，然后通過凝膠電泳

40、檢測(cè)PCR產(chǎn)物，根據(jù)是否得到PCR產(chǎn)物，以及產(chǎn)物的片段大小來判斷HPA基因型。方法簡(jiǎn)便、快速、錯(cuò)誤率低，是目前采用的HPA基因分型方法中的首選方法 ，對(duì)HPA 1．5系統(tǒng)均可以進(jìn)行基因分型，特別是針對(duì)GpⅡb／II1a抗體與血小板同源表位分析的研究。,PCR-特異性寡核苷酸探針雜交分析(PCR-SSOP)：此方法的第一步是使用PCR擴(kuò)增某一段HPA基因，然后通過與順序特異性寡核苷酸探針的雜交來鑒定HPA型，如檢測(cè)HPA1-4。由于檢測(cè)結(jié)

41、果與探針的序列以及試驗(yàn)條件密切相關(guān)，需要嚴(yán)格控制雜交溫度和時(shí)間,PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR．RFLP):使用PCR擴(kuò)增HPA基因片段后，用特定的限制性內(nèi)切酶水解，然后凝膠電泳分離被酶解的DNA片段，根據(jù)這些片段的分布格局指定相應(yīng)的基因型．因?yàn)殡p等位基因中的一條就包含一個(gè)特異性限制性位點(diǎn)，所以對(duì)HPA．1、2、3和7系統(tǒng)就可以使用PCR．RFLP方法。此方法較PCR．SSP增加了內(nèi)切酶水解步驟，如果酶解不完全將得錯(cuò)誤結(jié)果。此

42、外，并非每個(gè)HPA等位基因都有適當(dāng)?shù)拿盖悬c(diǎn)。,血小板抗體的檢測(cè)技術(shù)無論是檢測(cè)血小板自身抗體，還是檢測(cè)血小板同種抗體，都比檢測(cè)其他血液成分抗體困難得多。雖然現(xiàn)存的檢測(cè)技術(shù)很多，但至今還沒有一種真正具有臨床實(shí)用價(jià)值的血清學(xué)檢測(cè)方法;現(xiàn)有的技術(shù)和方法所得的結(jié)果差異較大;分子生物學(xué)的方法可以預(yù)測(cè)血小板血型的表現(xiàn)型，但實(shí)際的血型抗原卻無法用該技術(shù)檢測(cè)，而且DNA技術(shù)不能用于抗體的篩選，至少目前還沒有合適的分子生物學(xué)方法可用 技術(shù)上要求很高

43、，不適合臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。,血小板血型檢測(cè)方法評(píng)價(jià),血小板血清學(xué)檢測(cè)落后的原因,試劑的原因 至今仍是人免疫血清試劑,沒有研制成功抗HPA的單克隆抗體，已經(jīng)研制成功的單抗都是抗血小板糖蛋白的血型抗原載體的單克隆抗體。因此，抗人血小板血型抗體在世界范圍內(nèi)都比較短缺和珍貴。目前尚無特異性高、純度高的試劑。,血小板血清學(xué)檢測(cè)落后的原因方法學(xué)問題。目前尚無有效方法高速、準(zhǔn)確測(cè)定血小板抗體。目前世界范圍內(nèi)推薦兩種方法：抗體固著血

44、小板抗原分析；使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光分析。缺點(diǎn)：操作復(fù)雜、耗時(shí)、試劑依賴進(jìn)口價(jià)格昂貴，難以在臨床上常規(guī)使用。,1. 1病例和血液標(biāo)本 7名患者( 編號(hào)A-G )分別在四川大學(xué)華西附二院、四川省人民醫(yī)院和成都市兒童醫(yī)院等住院治療?；颊呔休斞泛脱“遢斪⑹贰；颊咭蜓“鍞?shù)低,或因有出血征兆, 申請(qǐng)血小板配型輸注。我們采集患者血液標(biāo)本檢查有關(guān)抗體, 并進(jìn)行血小板配型輸注治療(除患者G為特發(fā)性血小板減少性紫癜( ITP), 未接受輸注

45、治療外)。,1. 2核酸提取 用美國(guó)Gentra試劑提取患者和血小板供者血液標(biāo)本中DNA。1. 3 HLA、HPA 抗原基因分型檢測(cè) 采用美國(guó)G&T 公司的HLA-A、B、DR 基因分型試劑和HPA1-16基因分型試劑對(duì)患者和血小板供者進(jìn)行HLA、HPA 抗原基因分型。1. 4血小板相關(guān)抗體( PA IgG)檢測(cè) 用上海血液中心提供的SEPSA試劑檢測(cè)患者血清中PAIgG,1. 5 抗HLA抗體、部分HPA同種抗體檢測(cè) 用P

46、AK12試劑對(duì)患者血清中可能存在的HLA抗體和部分HPA 特異抗體(H PA􀀂1a、􀀂1b、􀀂3a、􀀂3b、􀀂5a、􀀂5b抗體)進(jìn)行檢測(cè)。1. 6血小板供者篩選和配型輸注 從100 名已定型的血小板供者庫中挑選與患者ABO血型相同, HLA和H PA基因位點(diǎn)最大相合的血小板供者, 采集血小板, 進(jìn)行血小板配型輸注治療。,多次輸血

47、的患者會(huì)產(chǎn)生血小板抗體, 是同種免疫引起血小板減少的主要原因。臨床表現(xiàn)為患者血小板輸注無效以及血小板減少等。本研究中除患者F未做血小板相關(guān)抗體檢測(cè)外, 其余6位患者( 包括1名IPT患者)都檢測(cè)出至少有1種血小板相關(guān)抗體, 抗體陽性率100%。在血小板輸注治療時(shí), 存在不同程度的同種免疫性血小板減少。孫曉明等也報(bào)道血小板相關(guān)抗體與患者血小板輸注無效有關(guān)。所以,進(jìn)行血小板配型輸注治療十分必要, 一則可提高血小板輸注療效; 二則可減少和預(yù)防

48、輸血引起的同種免疫反應(yīng), 對(duì)患者今后輸血治療有益。,討論,我們歸納了6名患者10次血小板輸注的療效, 其輸注后24h Plt增加和CC I值變化較大。除1 次血小板輸注外,輸注后患者的Plt都有不同程度的提高( 平均為10 x 109 /L)。按24h CC I值> 4.5 x 109 /L的標(biāo)準(zhǔn), 有5次血小板輸注有效。,同種免疫只是影響血小板輸注療效的眾多因素之一。每次血小板輸注療效都要具體分析。例如, 患者D 與供者HLA完

49、全不合、HPA不合, 又有PA IgG、HLA-I、HPA抗體, 導(dǎo)致血小板輸注無效( CC I為0.72 )。患者F在骨髓移植后的1個(gè)月內(nèi), 一直伴有低燒, 血小板數(shù)很低, 隔天輸注機(jī)采血小板1袋, 其血小板數(shù)緩慢升高, 但沒有出血癥狀發(fā)生, 可以認(rèn)為其血小板輸注對(duì)防止出血是有效的。,Schlossberg的調(diào)查也證明, 2 /3的骨髓移植患者在輸注血小板24h 后CC I值遠(yuǎn)< 4.5 x 109 /L。觀察血小板數(shù)增加只是評(píng)

50、價(jià)血小板輸注療效的一個(gè)指標(biāo), 應(yīng)該結(jié)合臨床情況進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。目前, 國(guó)內(nèi)外都有機(jī)構(gòu)建立了一定規(guī)模的已定型血小板供者庫, 用于血小板配型輸注治療。我們的100人供者庫, 在配型挑選上無法滿足實(shí)際需要。尤其是H LA 配型, 最多也只有3個(gè)位點(diǎn)相合, 多數(shù)情況只有1-2 個(gè)位點(diǎn)相合, 結(jié)合H PA配型和血小板抗體交叉配型, 難以達(dá)到血小板配型輸注的要求, 在一定程度上削弱了輸注療效。因此擺在我們面前的一個(gè)問題是要擴(kuò)大供者庫, 以盡量滿足患

51、者的需要。,總結(jié)（1）,對(duì)于不相合的紅細(xì)胞輸注，人們肯定不能容忍，而對(duì)于不相合的血小板輸注，人們卻認(rèn)為是常規(guī)。 事實(shí)上，血小板輸注無效，往往也伴隨著死亡――出血而亡。,總結(jié)（2）,臨床上血小板輸注無效通常是非免疫性因素引起的。同種免疫性血小板輸注無效多由HLA抗體引起 。輸血和妊娠是引起HLA同種免疫兩種主要的危險(xiǎn)因素。,總結(jié)（3）,對(duì)血小板抗體進(jìn)行篩選和鑒定，而后選擇相應(yīng)抗原陰性的血小板進(jìn)行交叉配型，陰性者進(jìn)行輸注，這種類似于目

52、前紅細(xì)胞配血的方法，是最有效的PTR應(yīng)對(duì)策略。,我國(guó)目前血小板檢測(cè)中存在的問題,三個(gè)不知道患者和獻(xiàn)血者都不知道血小板血型血小板與疾病的關(guān)系并無詳細(xì)的研究報(bào)道臨床很多時(shí)候?qū)颊卟恢罊z測(cè)哪個(gè)血小板血型,我國(guó)血小板輸注存在的問題,血小板血型與疾病之間相關(guān)性沒有詳細(xì)的報(bào)道和宣傳；臨床上很多情況下不知道檢測(cè)患者血小板血型；大多數(shù)血站和醫(yī)院輸血科在患者和獻(xiàn)血者的血小板血型都不清楚的情況下，就進(jìn)行血小板輸注，其遵循的原則就是ABO同型即

53、可就進(jìn)行血小板輸注，很少進(jìn)行HLA、HPA交叉配型以尋找相匹配的血小板，所以臨床上出現(xiàn)了許多血小板輸注無效癥以及血小板免疫性疾病難以診斷的問題；在我國(guó)，很少的城市和地區(qū)設(shè)立血小板供者庫。,隨著單采血小板臨床輸血量的逐年上升，血小板輸血反應(yīng)和輸注無效問題日益突出。臨床上為盡量減少血小板輸血反應(yīng)或輸注無效，必須做好血小板輸注前的標(biāo)本檢查和交叉配血試驗(yàn)。,建議解決方式：,提高臨床醫(yī)生、中心血站工作人員對(duì)血小板不配型輸注可能引發(fā)嚴(yán)重后果的充分