血小板制品細(xì)菌污染快速核酸檢測(cè)方法研究.pdf

1、近年來(lái)，血小板制品臨床需求量不斷上升。由于缺少經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法，血液制品細(xì)菌污染已成為了引發(fā)輸血膿毒血癥和致死的主要原因之一。目前最常用的培養(yǎng)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)且對(duì)儀器及人員要求高，無(wú)法滿(mǎn)足血液制品常規(guī)細(xì)菌篩查的需求。針對(duì)上述問(wèn)題，本研究首先采用通用引物對(duì)細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)段進(jìn)行了擴(kuò)增，用核酸層析技術(shù)對(duì)擴(kuò)增了進(jìn)行了可視化檢測(cè)。為了在緊急條件下也能對(duì)血小板細(xì)菌污染進(jìn)行檢測(cè)，我們隨后對(duì)NEMA（nickingenzymemedi

2、atedamplification）核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行了初步探索，并利用該技術(shù)對(duì)多種細(xì)菌污染進(jìn)行了檢測(cè)。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)選用通用引物和通用探針對(duì)細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記，并使用核酸層析檢測(cè)技術(shù)(nucleicacidlateralflowdipstick，LFD)完成擴(kuò)增子的可視化檢測(cè)。該方法比常規(guī)PCR(Polymerasechainreaction)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)靈敏10倍以上。該方法對(duì)

3、模擬的多種血小板細(xì)菌污染樣品的靈敏度分別達(dá)到5CFU/mL（肺炎克雷白氏桿菌）、35CFU/mL（銅綠假單胞桿菌）和6.5×104CFU/mL（表皮葡萄球菌）。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在2h內(nèi)完成，相比細(xì)菌培養(yǎng)等方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，使之更適合成為發(fā)放時(shí)點(diǎn)檢測(cè)方法。
　　(2)通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)，采用切刻酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(nickingenzymemediatedamplification，NEMA)擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌16SrDNA，證明

4、其可以擴(kuò)增至少450bp長(zhǎng)度的質(zhì)粒片斷。并通過(guò)優(yōu)化NEMA擴(kuò)增體系中的緩沖液，反應(yīng)溫度，Mg2+濃度，DMSO濃度等條件提高檢測(cè)靈敏度100倍，但海藻糖等反應(yīng)佐劑的使用對(duì)反應(yīng)并無(wú)明顯影響。
　　(3)設(shè)計(jì)了針對(duì)未知污染菌的通用引物，擴(kuò)增了多種污染菌的16SrDNA，并對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化。最后，我們將該方法應(yīng)用到緩沖液中真實(shí)細(xì)菌的檢測(cè)中。結(jié)果顯示，通用引物的設(shè)計(jì)對(duì)血小板中多種未知污染菌的檢測(cè)完全可行，利用四條引物可以保證NEMA擴(kuò)