碳點(diǎn)對(duì)稀有鮈鯽胚胎發(fā)育及生殖毒性效應(yīng).pdf

1、碳點(diǎn)（Carbon quantum dots，CDs）是一種新型納米材料，在環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物探針與成像、藥物運(yùn)輸?shù)确矫嬗兄鴱V泛的潛在用途。然而，對(duì)其生物毒性的報(bào)道很少，對(duì)毒性機(jī)制的研究也十分缺乏。根據(jù)2014年市場(chǎng)調(diào)查報(bào)道，估計(jì)當(dāng)年的碳納米材料的市場(chǎng)價(jià)值已達(dá)到20億美元。然而，隨著CDs用量的增加，環(huán)境排放量也將增加，不可避免地進(jìn)入水體，那么它是否會(huì)對(duì)水生生物有什么危害，還有許多未知。因此，本研究以稀有鮈鯽（Gobiocypris rar

2、us）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別就CDs對(duì)稀有鮈鯽胚胎早期發(fā)育毒性及成魚的生殖毒性效應(yīng)進(jìn)行探討。
　　本研究分成兩大部分：第一部分實(shí)驗(yàn)是探究CDs對(duì)稀有鮈鯽胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置：0（空白對(duì)照組）、1、5、10、20、40、80mg/L濃度組，采用水體浸泡暴露方式，在胚胎發(fā)育至12、24、48、72、96hpf（Hours post fertilization）時(shí)，檢測(cè)不同濃度CDs對(duì)稀有鮈鯽胚胎形態(tài)/行為指標(biāo)、生化指標(biāo)（抗氧化酶

3、、ATP酶）、發(fā)育相關(guān)基因（血管內(nèi)皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Vezf1）、Wnt8a、肌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制素（Mstn）、維甲酸受體α（RARα））mRNA表達(dá)、DNA損傷等方面的影響，對(duì)CDs誘導(dǎo)胚胎產(chǎn)生畸形/死亡的原因進(jìn)行探討。第二部分是探究CDs對(duì)稀有鮈鯽成魚的生殖毒性效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置為對(duì)照組（0.65％NaCl對(duì)照組）、20、40、80、160、320mg/L濃度組，采取腹腔注射的暴露方式，檢測(cè)不同濃度的CDs對(duì)稀有鮈鯽精子運(yùn)動(dòng)活力、精子DN

4、A損傷、受精率、子代的生長(zhǎng)發(fā)育情況以及一周后卵巢/精巢組織結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)不同濃度CDs誘導(dǎo)成魚的生殖毒性進(jìn)行探討。通過(guò)這兩部分的實(shí)驗(yàn)，初步探討CDs對(duì)魚類的早期發(fā)育毒性及生殖毒性效應(yīng)，旨在為CDs對(duì)生物的安全性評(píng)估提供基礎(chǔ)資料；通過(guò)生化指標(biāo)（抗氧化酶、ATP酶）、發(fā)育相關(guān)基因（Vezf1、Wnt8a、Mstn、RARα）定量分析、DNA損傷等方面的檢測(cè)，對(duì)CDs誘導(dǎo)胚胎產(chǎn)生畸形/死亡的原因進(jìn)行初步探討。
　　CDs對(duì)稀有鮈鯽胚胎發(fā)

5、育的毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示：CDs濃度組胚胎出現(xiàn)胚胎自主運(yùn)動(dòng)頻率減緩、心率加快、靜脈竇到動(dòng)脈球之間的距離（SV-BA）變長(zhǎng)、體長(zhǎng)縮短、心包囊/卵黃囊水腫、脊柱/尾部彎曲等多種毒性效應(yīng)，改變胚胎孵化時(shí)間，并導(dǎo)致孵化率降低。畸形率隨CDs濃度的升高而升高。Na+/K+-ATP酶活性隨CDs濃度的增大有降低趨勢(shì)，可能使Na+被泵出細(xì)胞的頻率受到影響，使Na+在細(xì)胞內(nèi)大量積聚，引起細(xì)胞水腫。此外，Vezf1隨CDs濃度增大而下調(diào)，影響了心血管功能，造

6、成胚胎心率加快。各CDs組胚胎的Ca2+-ATP酶活性呈濃度依賴性降低， Ca2+-ATP酶活性受到抑制，Ca2+在胚胎內(nèi)累積，促進(jìn)骨骼異常發(fā)育。Mstn以及Wnt8a隨CDs濃度增大表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)。Mstn負(fù)向調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其上調(diào)說(shuō)明肌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制。Wnt8a是體軸延伸的關(guān)鍵因子，Wnt8a上調(diào)說(shuō)明仔魚體軸延伸受到抑制。Ca2+-ATP酶活性降低會(huì)促進(jìn)骨骼發(fā)育，而Mstn和Wnt8a上調(diào)抑制肌細(xì)胞生長(zhǎng)和體軸延伸，因此稀有

7、鮈鯽胚胎出現(xiàn)脊柱、尾部出現(xiàn)彎曲。Mstn72hpf上調(diào)顯著，這與72hpf后畸形率顯著升高，仔魚體全長(zhǎng)低于對(duì)照組相一致。
　　超氧化物歧化酶（SOD）活力呈現(xiàn)出被誘導(dǎo)狀態(tài)，過(guò)氧化氫酶（CAT）和SOD變化有一定的同步性。CAT和SOD變化同步可能是由于SOD歧化活性氧（ROS）會(huì)產(chǎn)生大量的過(guò)氧化氫（H2O2），從而誘導(dǎo)CAT產(chǎn)生。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）活力在12、24hpf均較低，可能是因?yàn)镾OD和CAT活力上升，清除自由基

8、，氧化應(yīng)激能力有所恢復(fù)，未誘導(dǎo)GPX產(chǎn)生。隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，GPX被顯著激活，協(xié)同CAT對(duì)抗氧化應(yīng)激，清除SOD歧化ROS的產(chǎn)物——H2O2。通過(guò)GPX、SOD、CAT酶活性的變化，看出抗氧化酶聯(lián)合清除體內(nèi)多余的自由基，使低濃度組的稀有鮈鯽胚胎機(jī)體內(nèi)丙二醛（MDA）維持在一定含量，但20~80mg/L濃度組長(zhǎng)時(shí)間暴露，超出機(jī)體抗氧化防御能力范圍，誘導(dǎo)MDA維持在較高水平?？寡趸富钚员徽T導(dǎo)與MDA含量的升高說(shuō)明CDs暴露對(duì)稀有鮈鯽胚胎/仔

9、魚產(chǎn)生了氧化脅迫，這可能是造成其胚胎發(fā)育異常的一個(gè)原因。隨CDs濃度的增大及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，稀有鮈鯽胚胎/仔魚DNA損傷程度逐漸增加，畸形率與死亡率也升高。這說(shuō)明CDs暴露對(duì)稀有鮈鯽胚胎造成了DNA損傷，從而導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)畸形或死亡。
　　CDs對(duì)稀有鮈鯽成魚的生殖毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示：CDs處理會(huì)對(duì)稀有鮈鯽精巢結(jié)構(gòu)的具有一定損傷，主要影響表現(xiàn)在精小葉及精小囊基膜溶解、斷裂，基膜中的部分細(xì)胞周圍形成空泡。此外，還表現(xiàn)在隨CDs處理濃度的

10、增大，雄魚的GSI減??；精子有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間及激活率都有降低的趨勢(shì)；雄魚精子DNA受到一定程度的損傷。在對(duì)子代受精卵的受精率和畸形率統(tǒng)計(jì)中，發(fā)現(xiàn)CDs處理組受精率低于對(duì)照組，而畸形率高于對(duì)照組，可能是CDs對(duì)雄魚精巢結(jié)構(gòu)的損傷以及精子DNA損傷導(dǎo)致精子活力和受精力降低，最后造成受精率下降及后代畸形率升高。此外， CDs處理使稀有鮈鯽20、80、320mg/L濃度組雌魚產(chǎn)卵次數(shù)減少，對(duì)稀有鮈鯽的繁殖行為產(chǎn)生了抑制。此外，高濃度組（160、32

11、0mg/L）卵巢出現(xiàn)一定程度卵細(xì)胞退化，可能是CDs處理組雌魚產(chǎn)卵次數(shù)減少的一個(gè)原因。
　　本研究結(jié)果表明：（1）一定濃度CDs對(duì)稀有鮈鯽胚胎/仔魚有明顯的發(fā)育毒性，引起胚胎自主運(yùn)動(dòng)頻率減緩、心率加快、靜脈竇到動(dòng)脈球之間的距離（SV-BA）變長(zhǎng)、體長(zhǎng)縮短、心包囊/卵黃囊水腫、脊柱/尾部彎曲等多種毒性效應(yīng)，改變胚胎孵化時(shí)間，并導(dǎo)致孵化率降低；Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性及發(fā)育相關(guān)基因的變化會(huì)造成胚胎畸形；氧化應(yīng)激、