稀有鮈鯽dead end基因的克隆及其功能研究.pdf

1、稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）作為一種小型鯉科魚類，已成為我國一種新型理想的實驗模式動物，但是關于稀有鮈鯽生殖細胞的發(fā)生和性腺分化的機制還不是很清楚，有關稀有鮈鯽deadend(dnd)基因的克隆、表達模式以及功能的研究至今未見報道。本研究首先克隆稀有鮈鯽dnd基因的保守片段以及全長序列，進行了序列的比對分析;其次研究了dnd基因在稀有鮈鯽各個組織以及胚胎不同發(fā)育時期的表達情況;同時合成了地高辛標記的RNA探針，通過胚胎整

2、體原位雜交觀察dnd基因在胚胎中的表達及遷移的情況;最后構建了pCS2+-dn重組質(zhì)粒，進行dnddsRNA以及dndmRNA的體外轉(zhuǎn)錄，以期研究稀有鮈鯽dnd基因?qū)ι臣毎l(fā)育的影響。通過dnd基因的研究提供魚類生殖細胞新的標記基因，利于今后的基礎和應用研究，為以dnd為目標的全雄魚或不育轉(zhuǎn)基因魚的培育提供基礎資料。
　　一、采用RT-PCR和SMARTerTMRACE-PCR擴增技術，得到了稀有鮈鯽dnd基因1718bp的全長

3、cDNA序列，其中5'非編碼區(qū)80bp，3'非編碼區(qū)471bp，開放閱讀框為1167bp，共編碼388個氨基酸殘基，含一個由73個氨基酸殘基組成的RRM結構域。將稀有鮈鯽與代表性物種的Dnd氨基酸序列進行多重序列比對以及系統(tǒng)進化分析，結果發(fā)現(xiàn)，Dnd具有很強的保守性，除了特有的RRM結構域外，還包含5個保守結構域，1個N-末端區(qū)域和4個C-末端區(qū)域，其中RRM為主要的功能結構域。
　　二、運用RT-PCR技術，分析稀有鮈鯽dnd基

4、因的表達模式。RT-PCR結果顯示，dnd因特異性地在稀有鮈鯽的性腺中表達，并且dnd基因在卵巢中的表達量高于精巢中的表達量，但沒有顯著性的差異(P＞0.05)。推測，dnd基因在稀有鮈鯽性腺發(fā)育和分化過程中起重要的作用。在胚胎發(fā)育階段，dnd基因在胚胎的整個發(fā)育過程中持續(xù)表達，從胚胎的合子期一直到囊胚期，dnd基因維持較穩(wěn)定的高水平表達;從原腸胚期表達量有所下降，在出苗期達到了最低水平，并且合子期到囊胚期的表達較之后幾個時期的表達差異

5、極顯著(P＜0.01)。推測，稀有鮈鯽的dnd基因是一個母源性基因，在整個胚胎發(fā)育以及PGCs的遷移過程中起著重要的作用。
　　三、合成地高辛標記的RNA探針，進行胚胎整體原位雜交。結果顯示，稀有鮈鯽dndmRNA信號在胚胎2-細胞期的卵裂溝形成兩個信號點，在4-細胞期的卵裂溝變成四個點，從3h開始，dndmRNA的信號向下遷移，4h、6h之后對齊分布在胚軸的兩邊，最終遷移進入性腺;其中在2-細胞到4h期間，稀有鮈鯽dnd基因的表

6、達量較高，6h開始表達信號有所下降，驗證了dnd基因在胚胎不同發(fā)育時期表達的RT-PCR結果，并且與稀有鮈鯽vasa基因的表達特點、表達位點以及在性腺中遷移的情況一致，說明了dnd基因為稀有鮈鯽生殖細胞特異性表達的基因，可能參與PGCs的遷移及配子的發(fā)生，在性腺發(fā)育和生殖細胞分化的過程中具有重要的作用。
　　四、構建pCS2+-dnd重組質(zhì)粒，進行dnddsRNA以及dndmRNA的體外轉(zhuǎn)錄，以期研究稀有鮈鯽dnd基因?qū)ι臣毎l(fā)