基于HPG軸五氯酚對稀有鮈鯽內(nèi)分泌干擾效應(yīng)機制的研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmentalendocrinedisruptors，EEDs)或內(nèi)分泌干擾化學物(EndocrineDisruptingChemicals，EDCs)是一類自然界存在或者人工合成的化合物，干擾動物體內(nèi)激素的合成、釋放、運輸、代謝，與受體結(jié)合，影響功能表達等一系列生物過程，協(xié)同或拮抗天然內(nèi)源性內(nèi)分泌激素的作用。五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)。在中國，長江

2、中下游11個省、市、自治區(qū)被大范圍、長時間地用作殺滅釘螺和控制血吸蟲病，作為廉價而高效的農(nóng)藥，被用作木材保存劑。研究表明PCP具有很強的致癌性，致畸性和致突變性，對生殖系統(tǒng)有很大的破壞，導致人類荷爾蒙的改變。PCP能在生物體內(nèi)累積，進入水體生態(tài)系統(tǒng)對水環(huán)境造成持久性污染。目前對于PCP的研究大多集中在其毒性方面。隨著研究進展，PCP也被視作內(nèi)分泌干擾物，但PCP具有雌激素效應(yīng)還是抗雌激素效應(yīng)仍存在分歧?；谙虑鹉X-垂體-性腺(Thehy

3、pothalamic-pituitary-gonadalaxis，HPGaxis)軸對PCP作為內(nèi)分泌干擾物的研究很有限。其內(nèi)分泌干擾(ED)作用的機制，并沒有得到更好的更廣泛的研究。
　　 本實驗采用我國特有的魚種稀有鮈鯽對PCP的內(nèi)分泌干擾機制進行研究。
　　 目的解決(1)PCP雌激素以及抗雌激素效應(yīng)的爭議，確定PCP是否具有雌激素作用(2)PCP的內(nèi)分泌干擾作用是通過受體還是和非受體途徑以及二者共同作用完成，為P

4、CP的內(nèi)分泌干擾受體和非受體途徑提供初步證據(jù)(3)確定PCP的內(nèi)分泌干擾作用如何通過下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸起作用。研究PCP對稀有鮈鯽內(nèi)分泌干擾作用的機制，運用熒光定量PCR的方法，對雄性稀有鮈鯽HPG軸相關(guān)的基因進行表達分析。利用半靜態(tài)水體暴露的方法將稀有鮈鯽暴露在8，16，80，160μg/LPCP，50ng/LEE2陽性對照組和DMSO陰性對照組。進行21天的暴露處理。利用PCP對稀有鮈鯽卵黃蛋白原轉(zhuǎn)錄豐度的影響來研究PC

5、P的雌激素效應(yīng)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，低濃度的PCP處理后，HPG軸相關(guān)組織、大腦、肝臟、性腺中。VTG1和VTG2的表達量呈現(xiàn)明顯的誘導趨勢，呈現(xiàn)PCP的計量依賴效應(yīng)。對于高濃度的PCP和肝臟組織尤其明顯。PCP對VTG基因的誘導說明PCP具有雌激素作用。
　　 研究PCP內(nèi)分泌干擾機制的受體途徑，利用半靜態(tài)水體暴露的方法將稀有鮈鯽暴露在8，16，80，160μg/LPCP，50ng/LEE2陽性對照組和DMSO陰性對照組。

6、進行21天的暴露處理。利用PCP對稀有鮈鯽類固醇受體基因豐度的影響來研究PCP雌激素效應(yīng)的受體途徑。結(jié)果顯示，與陰性對照相比，除了ERβ2在肝臟組織中有不明顯的下降趨勢，所有其他的類固受體基因在4個濃度PCP和陽性對照組EE2暴露后均呈現(xiàn)誘導趨勢。盡管在肝臟組織中，ERβ2有下降趨勢，AR,ERα和ERβ1在該組織中有明顯的誘導趨勢。對于低濃度的PCP來說，AR,ERα，ERβ1和ERβ2對8和16μg/LPCP更為敏感。在這兩個濃度中

7、AR，ERα，ERβ1和ERβ2表達量誘導效果非常明顯。因此類固醇受體組基因證明了PCP通過受體途徑干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)。
　　 研究PCP內(nèi)分泌干擾機制的非受體途徑，利用半靜態(tài)水體暴露的方法將稀有鮈鯽暴露在8，16，80，160μg/LPCP，50ng/LEE2陽性對照組和DMSO陰性對照組。進行21天的暴露處理。利用PCP對稀有鮈鯽關(guān)鍵酶基因豐度的影響來研究PCP雌激素效應(yīng)的非受體途徑。關(guān)鍵酶基因包括細胞色素P450(CYP3A，

8、CYP17，CYP19a，CYP19b)和HMGR。分別檢測半靜態(tài)水體暴露后這些基因在HPG軸相關(guān)組織中表達量的改變。通過8，16，80，160μg/LPCP和50nMEE2維持21天的暴露處理。CYP3A在大腦和性腺中表達量明顯下降，在肝臟中呈現(xiàn)不明顯的上升。CYP17在大腦和肝臟中明顯被PCP抑制，在性腺中有微弱的上升，CYP19a在大腦和肝臟表達量被PCP抑制，然而于80μg/LPCP肝臟和16μg/LPCP性腺中呈現(xiàn)一定的上升反

9、彈。與其他細胞色素基因相反，CYP19b于肝臟、大腦和性腺中整體呈現(xiàn)誘導趨勢。HMGR基因除80μg/L的PCP在肝臟中有上升的趨勢以外在所有三種組織其它濃度PCP范圍內(nèi)表現(xiàn)出下降趨勢。總體來說，細胞色素組基因并未與PCP呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。在HPG軸相關(guān)的三個組織中，大腦組織CYP3A，CYP17，CYP19a和HMGR在4個濃度PCP中表達量均被抑制。這與肝臟組織16，80μg/LPCP濃度下，4個基因的表達量均有反彈性增加，可能與魚

10、類自身存在的內(nèi)源性調(diào)節(jié)相關(guān)。
　　 因此經(jīng)過21天8，16，80，160μg/LPCP4個濃度的暴露。雌激素標志物VTG基因的表達量整體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，結(jié)果表明PCP存在雌激素效應(yīng)。和VTG相同，類固醇受體基因表達量被誘導說明PCP經(jīng)過受體途徑影響內(nèi)分泌系統(tǒng)，類固醇受體基因?qū)τ诟邼舛鹊腜CP作用更敏感，為后續(xù)確定PCP對類固醇受體敏感濃度奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。關(guān)鍵酶基因在整體誘導過程中呈現(xiàn)下降趨勢，說明PCP影響內(nèi)分泌過程中非受體途徑中的