氰氟草酯降解菌分離鑒定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因(chbH)的克隆和表達.pdf

1、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)是一種芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，其在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化和分解等環(huán)境行為及其對人類健康的潛在危害正日益受到關(guān)注，分離篩選能降解氰氟草酯的微生物并研究其降解機制具有非常重要的理論和應(yīng)用價值。
　　 本文通過對長期受芳氧苯氧丙酸類除草劑污染的稻田土壤中進行富集篩選，分離到五株能降解氰氟草酯菌株，分別命名為QDZ-1，QDZ-A，QDZ-B，QDZ-C，QDZ-D.經(jīng)過形態(tài)、生理生化實驗及16S

2、rRNA基因序列分析，分別鑒定其屬 Pseudomonas sp。(QDZ-1)，Agromyces sp.(QDZ-A)，Stenotrophomonas sp.(QDZ-B)，Aquamicrobium sp。(QDZ-C)，Microbacterium sp.(QDZ-D)。經(jīng)過對降解效果進行比較，選擇一株較高效氰氟草酯降解菌QDZ-1為研究對象，并對其生物學(xué)特性進行研究。
　　 菌株QDZ-1無芽孢、革蘭氏陰性、短桿狀、

3、一端生多根鞭毛。在LB固體平板培養(yǎng)兩天后，菌落圓形、邊緣光滑、呈黃色。能在15℃-37℃生長，最適生長溫度為25℃-30℃，菌株ODZ-1在pH5.5-10.0范圍內(nèi)生長良好，當(dāng)pH低于5.5菌株的生長明顯受到抑制，最適pH值為7.0，好氧性生長，QDZ-1的最適生長NaCl濃度是0.5％，當(dāng)NaCl濃度小于2.5％時，菌體生長良好，當(dāng)NaCl濃度大于3.5％時，生長受到明顯的抑制。
　　 菌株QDZ-1能夠以氰氟草酯為唯一碳源

4、進行生長，經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，降解率達到84.5％。菌株QDZ-1降解氰氟草酯的最適溫度為30℃，最適pH為7.0。QDZ-1同樣也能降解其他芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，5 d能降解68.9％的禾草靈，64.6％的精吡氟氯禾靈，92.6％的精喹禾靈，90.8％的精惡唑禾草靈和79.6％的精吡氟禾草靈。菌株和菌株的粗酶液能夠在有農(nóng)藥(150 mg/L)的平板上產(chǎn)生水解圈。通過質(zhì)譜機檢測到QDZ-1以氰氟草酯為唯一碳源的液體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中代謝此農(nóng)

5、藥時產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。在對代謝物結(jié)構(gòu)的分析基礎(chǔ)上推測了QDZ-1降解氰氟草酯的代謝途徑。結(jié)果表明QDZ-1在降解氰氟草酯時，首先斷裂其結(jié)構(gòu)核心-酯鍵生成氰氟草酸，其次醚鍵斷裂脫羧，最后氰基酰胺化。
　　 通過構(gòu)建基因組DNA文庫，以氰氟草酯水解為氰氟草酸產(chǎn)生的透明水解圈作為氰氟草酯水解酶活力篩選標(biāo)記，成功從菌株P(guān)seudomonas sp.QDZ-1中克隆到一個新的氰氟草酯水解酶基因，命名為chbH。通過Omiga軟件分析chbH

6、具有996堿基得到編碼332個氨基酸，分子量為36 KDa。ChbH推測的氨基酸序列在NCBI的蛋白序列數(shù)據(jù)庫中比對，結(jié)果表示chbH編碼蛋白屬于酯(脂肪)酶超家族。chbH編碼蛋白與一些假設(shè)或推測性水解酶相似性最高；與Pseudomonas fluorescens的酯酶，82％的同源性；與Ralstonia eutropha H16的水解酶，50％的同源性；Burkholderia multivorans ATCC17616的α/β-

7、水解酶，48％的同源性。以pET29a為表達載體，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET29a-chbH，實現(xiàn)了ChbH蛋白在E.coli BL21(DE3)中的融合表達，并用鎳離子親和層析柱純化融合蛋白ChbH。ChbH能水解多種芳氧苯氧丙酸酯類除草劑如精喹禾靈、精惡唑禾草靈、氰氟草酯、禾草靈和精吡氟氯禾靈。水解速率順序為：精喹禾靈≈精惡唑禾草靈>氰氟草酯>禾草靈≈精吡氟氯禾靈。醇鏈長度嚴(yán)重影響芳氧苯氧丙酸酯類除草劑的生物降解，對具有相同的醇鏈長度的不同