生物轉化常見反應類型

1、第三章 介紹生物轉化的常見反應類型,以甾體化合物的生物轉化為例進行闡述甾體化合物和甾體藥物簡介 甾體化合物結構 甾類化合物常見種類,甾體化合物和甾體藥物簡介,1952年，美國普強藥廠的Morray和Pereroon首次利用黑根霉將黃體同轉化為11?黃體酮，人們開始認識到甾體微生物轉化在甾體藥物生產中的重要性。微生物幾乎對甾體的每個位置都能進行轉化。幾種重要的甾體微生物轉化發(fā)應如羥化，脫氫成為工業(yè)上生產甾體激素及其類

2、似物的重要手段,甾體化合物,一類含有環(huán)戊烷多菲核的化合物在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羥基、酮基；A，B環(huán)有部分雙鍵；17位有不同的測鏈。,目前甾體微生物轉化中受到人們廣泛關注的領域,將微生物基因工程的新技術應用于甾體微生物轉化提高水不容性底物的溶解度細胞和酶的固定化以利于酶的重復經濟利用發(fā)展經濟有效的產物連續(xù)回收方式將環(huán)糊精等應用于培養(yǎng)基以提高產量,甾體化合物結構,甾體化合物編號,甾類化合物

3、常見種類,動物組織中：膽固醇、膽酸、皮脂素、皮脂醇（氫化可的松）、皮脂酮等 睪酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。 植物中：薯芋皂豆甾醇 酵母細胞：麥角固醇,甾體化合物編號,甾類化合物常見種類,動物組織中：膽固醇、膽酸、皮脂素、皮脂醇（氫化可的松）、皮脂酮等 睪酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。 植物中：薯芋皂豆甾醇 酵母細胞：麥角固醇,甾體類激素藥,腎上腺皮脂激素類 可的松、強的松

4、、氫化可的松 功能：抗炎、抗毒、抗過敏 對風濕、類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡等有治療作用。生殖腺激素 孕酮、雌酮 功能：調節(jié)內分泌人工合成避孕藥 長效孕酮等,微生物在甾體藥物生產中的應用,主要分為兩大類將天然原料轉化為生產甾體化合物的普通中間體。 如植物皂角苷羥化生成皂角苷配基 降解甾醇邊鏈生成有用的甾體化合物中間體， 雄甾－4－烯－3，17－二

5、酮； 雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮。轉化成特殊的甾體化合物的中間體，以生產我們所需要的產物。 如：甾體11?，11?及16?羥化， ?1 脫氫 甾體邊鏈降解,微生物對甾體化合物的轉化,微生物對甾體化合物的轉化多種多樣它們對甾體的每一位置上的原子或基團都有可能進行生物轉化。其反應類型主要有氧化、還原、水解、酯化等等。包括甾體母核上

6、和測鏈上的某個位置的羥基化、酮基化、環(huán)氧化、脫氫形成雙鏈、芳香化、開環(huán)、形成內酯、側鏈斷裂、降解。,羥基化反應,是甾體微生物轉化中最重要的反應?；瘜W法除了較容易在C17引入羥基外，在其他位置都很難引入羥基。,微生物對甾體的羥基化作用,微生物能在甾體的任何位置進行羥基化發(fā)應，也可在非甾類有機分子上羥基化。簡單的羥基化作用是在甾體的某個位置上引入O原子。在甾核上至少有21個位置可以發(fā)生。11位羥基化作用最重要，11位C的氧化對可的松

7、藥物療效是不可缺少的，11?，11?。除11位C進行羥基化反應外，9?，14?，16?的羥基化，在制備甾體藥物時，生產皮質甾類化合物及其類似物。,進行甾體羥基化作用的微生物,羥基化反應機理,羥基化反應,由于這些酶能將一摩爾分子氧引入底物，因此被定義位單氧化酶。這種細胞色素p450依賴的單氧化酶存在于幾乎所有形式的生命體中，以游離或膜結合的形式存在。,同位素實驗證明,甾體羥基化中存在的問題,環(huán)糊精的生理作用,Hesselink等研究：

8、 應用環(huán)糊于分枝桿菌甾體邊鏈的降解。環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡聚糖，一般由6－8個葡萄糖分子通過?－1，4糖苷鍵連接而成。易溶于水。含有疏水性空腔，可與疏水性分子結合?？勺鳛閹追N甾體類藥物的穩(wěn)定劑和增溶劑。,環(huán)糊精的應用實例1,Chincholkar 等研究了在?環(huán)糊精存在時，Currularia VKMF-644對11－脫氫皮甾醇（Reichstein S化合物，簡稱化合物S）的11?羥基化。在底物濃度為4g/L時：化合物S： ?

9、－CD＝1.0:0.6 氫化可的松的產率為70％－75％無?－CD： 氫化可的松的產率為40％－50％,環(huán)糊精的應用實例2,GD：19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－雙酮 經Penicillium raistrickii進行15?羥基化――――口服避孕藥?5－D－十八甲基炔諾酮（gestodene）的重要中間體。Schlosser等研究表明：在?－環(huán)糊精存在時，菌株或其固定化細

10、胞對CD的15?羥基化作用，與以甲醇做溶劑比較，其轉化率都能明顯提高。,?環(huán)糊精作用,?環(huán)糊精有利于提高甾體底物溶解度真菌能以?環(huán)糊精作為C源,其他重要的羥基化反應,地索高諾酮（destogestrel） 新型避孕藥（荷蘭Organon公司推出） 作用：月經周期控制好，副作用少，避孕可靠我國研究：上海醫(yī)科大學史紀平19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－雙酮―――11?羥基化（金龜子綠僵菌）形成關鍵中間體簡化合成路

11、線，降低副反應。底物：0.2% 轉化率：36％,甾體的邊鏈降解,側鏈降解,微生物對甾體側鏈的降解，解決了天然甾體化合物作原料合成甾體激素的問題，為利用原價的原料開辟了新的途徑。常見微生物有：簡單節(jié)桿菌球形芽孢桿菌玫瑰芽孢桿菌淡紫青霉藤黃諾卡氏菌,甾體邊鏈降解甾體母核降解,3?－羥基－?5甾醇,9?羥基化，?1，2脫氫,甾體邊鏈降解,采用類似脂肪酸?氧化的氧化過程，最后形成C17酮甾體。,選擇性邊鏈降解問題,選擇性邊鏈降

12、解策略（3） 輔助基因工程提高邊鏈降解的產率策略,選擇性甾體邊鏈降解措施1,對甾醇進行結構改造，從而阻止酶對母核的降解 例如：1965 Sih等 將膽固醇先行改造為19羥基衍生物 再經一步微生物轉化為A環(huán)芳香化的雌酚酮。,選擇性甾體邊鏈降解措施2,加入酶抑制劑，抑制母核降解關鍵酶如：C 1，2脫氫酶和9?羥化酶。 如： Ni Co Pb Se 8－羥基喹啉應用于多種分

13、枝桿菌對膽固醇的選性邊鏈降解 金屬鰲合劑 2，2－雙聯(lián)吡啶 抑制母核降解,選擇性甾體邊鏈降解措施3,對菌株進行誘變，產生僅降解甾醇側鏈的突變株例如：原始菌株經誘變?yōu)?誘變菌株Mycobacterium sp，NRRL-B3683 不加抑制劑，便產生雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD）再誘變得Mycobacterium sp，NRRL-B3805， 無C 1，2脫氫酶

14、 能產生雄甾－4－烯－3，17－二酮（AD）,基因工程新技術的應用,專利： Pseudomonas 菌株無降解甾體的能力將Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA導入Pseudomonas 菌株中獲得重組菌。重組菌可在水相，一種或幾種有機相中進行轉化反應。Pseudomonas 菌株比Mycobacterium sp NRRL-3683的生長輸率快結果加快轉化進程，降低成本。,方法,分離純化Mycobac

15、terium sp NRRL-3683 的DNA整合到特定質粒載體中導入?噬菌體中用入?噬菌體感染E.coli HB101，得E.coli重組子三親雜交實現(xiàn)Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA到Pseudomonas 菌株得轉移。,如何提高甾體邊鏈降解的產率,接觸,提高甾體邊鏈降解速率,Hesselink等研究表明：環(huán)糊精能明顯增強Mycobacterium sp NRRL-3683 降解膽固醇、谷甾醇

16、等邊鏈生成AD的產率，不影響細胞生長速度和細胞密度。當環(huán)糊精：底物濃度=2:1時，微生物降解邊鏈的活性可增加1.7-3.0倍。環(huán)糊精能阻止母核的降解及產物的反饋抑制。,環(huán)糊精在甾體邊鏈降解中的作用總結,在甾體邊鏈降解過程中，環(huán)糊精充當： 惰性甾體增溶劑反應載體保護劑,甾體邊鏈降的成功應用,Arhna 和Sih等研究報道以膽甾醇和?－谷甾醇為原料微生物轉化法合成甾體藥物中間體的方法。采用酶抑制劑生化阻斷變株改變

17、細胞膜通透性等生物技術改造甾醇的結構，從而選擇性控制甾醇的邊鏈降解成功合成中間體 雄甾－4－烯－3，17－二酮（4－ AD） 雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD） 9?羥基－4－AD目的：工業(yè)生產性激素，利尿劑等甾體藥物,其他的甾體生物轉化反應類型,脫氫作用A環(huán)芳香,脫氫作用－使甾體核形成雙鍵,強的松（去氫可的松） 是可的松經脫氫而形成的。 其抗炎功效比可的松高幾倍

18、。一般制備該種藥物時，常常是將可的松或氫化可的松脫氫變?yōu)槿淇傻乃苫蛉錃浠傻乃伞?脫氫反應的常見微生物為,簡單節(jié)桿菌 各種芽孢桿菌（蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌） 鐮刀霉 長蠕孢菌屬。,A環(huán)芳香化,所謂A環(huán)芳香化 是指甾體A環(huán)核上的每個C原子都脫氫形成雙鍵，而變?yōu)榉枷慊Y構。 雌性激素的生產（雌二醇），可通過此方法獲得,研究生物轉化的幾種常用方法,第四章 研究生物轉化的幾種常用方法,間歇培養(yǎng)法整體細胞轉

19、化法洗滌均絲懸浮法（靜息細胞法）孢子轉化法原生質體實驗法遺傳特性誘變法同位素示蹤法,間歇培養(yǎng)法（Batch culture),這種方法能夠比較直接而簡單地篩選能否具有轉化某種化合物的活性菌株。,游離的整體細胞,游離的整體細胞直接作為催化劑來制造產品的報道已經不少在某種程度優(yōu)于固定化細胞在生物轉化酶工程中越來越受到重視游離整體細胞的基礎研究更為重要,游離整體細胞的基礎研究內容,細胞的滲透化酶的胞內固定化酶細胞在反應前后

20、的形態(tài)變化和結構變化,整體細胞轉化應用舉例,底物：富馬酸產物L－天冬氨酸生物轉化酶：天冬氨酸酶（EC4.3.1.1）轉化菌株：E.coli,整體細胞轉化研究,培養(yǎng)基,培養(yǎng)方法,不同底物濃度的反應速率,底物質量濃度較高時，在某一時間（8h）前，轉化速率較低，而后，反應速度加快。 對底物富馬酸鹽的轉化徹底。（99.2％）底物濃度較低時，反應速度始終較慢 對底物富馬酸鹽的轉化不徹底。（63％）特點：高質量底物濃度有

21、較高的反應速率高質量濃度底物有較高的轉化率催化反應一般有個遲滯期,酶細胞在生物轉化中的形態(tài)變化低底物濃度掃描觀察,,酶細胞在生物轉化中的形態(tài)變化高底物濃度掃描觀察,形態(tài)學變化,高質量底物濃度下細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學變化 細胞表面發(fā)上皺褶，有明顯的凹陷 細胞膜變薄，松弛、不明顯，內部結構變松，不致密。,高質量濃度底物對含酶細胞的滲透化作用,靜息細胞法,為了排除原培養(yǎng)基中自身的代謝產物對不同生長階段轉化的影響，常常用洗

22、滌的靜息細胞來代替發(fā)酵液中的生長的細胞，即將不同生長階段的細胞取出，洗去沾染的原培養(yǎng)液及其代謝產物，然后把細胞懸浮在人工轉化系統(tǒng)內，在一定條件 下進行生物轉化。,孢子轉化法,真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶活力高，且常常用于生物轉化。 細菌的內生孢子（芽孢），一般無轉化活性。,轉化方法,相似于靜息細胞法。 不采用完全培養(yǎng)基，只選用緩沖液或含有葡萄糖一類能源的物質即可。 通常轉化時使用的孢子濃度為108－109個

23、/ml. 轉化pH一般為5-6,原生質體試驗法,方法 通過溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等脫去細胞壁，獲得原生質體。 將原生質體懸浮于高滲穩(wěn)定液中，添加前體物質，進行喂養(yǎng)試驗，觀察結果。,原生質體試驗法特點,排除了細胞壁通透性障礙。保全了整體細胞的內酶系統(tǒng)。避免了無細胞抽提法中，用破碎細胞而損壞了酶體系，從而使某些需要偶聯(lián)的酶反應（氧化還原反應）不能進行的缺點。,遺傳特性誘變法,菌種誘變不僅是提高產量的重要手段，而且也是研

24、究生物轉化過程中，產物形成的遺傳機制的一種有效方法。將轉化菌進行誘變，使其失去轉化底物或形成某個中間體的能力，從而就可分離到生物轉化中的各種不同的障礙突變株，即負突變株。這種負突變株能夠積累某種代謝產物或支路代謝產物。從分析轉化菌和突變株的代謝產物化學結構上的 差異，找出這些代謝產物在合成中的相互關系，從而可推斷生物轉化的反應步驟。,同位素示蹤法,同位素示蹤法是研究生物轉化的好方法。即應用同位素轉化的起始物和中間體進行喂養(yǎng)試驗，由于試

25、驗菌沒有區(qū)別標記化合物及非標記化合物的能力，因此標記化合物和非標記化合物一樣，都能參與菌體的代謝變化，然后通過測定產物或中間體的同位素含量及分布情況，從而判斷試驗化合物是否參與生物轉化。缺點為了確定同位素的結合位置，必須將產物進行一系列的化學降解、分離和測定等大量工作。,近年研究概況,近年來，利用沒有放射性的穩(wěn)定同位素13C、2H、15N、18O等來作示蹤研究，特別是13C，可應用碳核磁共振儀來直接測定該生物轉化產物中間體的碳核磁共