造血干細(xì)胞表型及分離純化方法

1、造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,廠斬殉猖須極達(dá)遠(yuǎn)垣維并膳右么溺飲像怠匣壘冕世砌醚均嶺撅咬琳驕舔貓造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,一個多世紀(jì)前，由 Artur appenheim(1870~1916)提出。是一類同時具有自我更新和向各系血細(xì)胞分化能力的原始細(xì)胞群。,Hematopoietic Stem Cell,樟焦瑣鱗誰擅驕旋丙閻姬曲爪嵌齋折肛慷欠刑攆撤趕瞳土葷賓悟文很醬首造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞

2、表型及分離純化方法,支持干細(xì)胞存在的初始證據(jù),1.從小鼠獨特的染色體標(biāo)記中證實， 存在能同時產(chǎn)生淋巴和髓系細(xì)胞的 多能干細(xì)胞(pluripotent)。2.慢性髓性白血病同工酶分析可見， B淋巴細(xì)胞和髓樣細(xì)胞都來自慢性 髓性白血病干細(xì)胞克隆。,浮剁載貍的慚致拖教覓脅羌巖麓殖醇笛背燼樊招絨遜悠砷惑艇微荔耘黨喧造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,3.用帶有新霉素抗性基因標(biāo)志的逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體轉(zhuǎn)染鼠

3、骨髓細(xì)胞，分析 病毒特異聚集部位證實，不同淋巴 和髓系表型的細(xì)胞來自同一干細(xì) 胞。4.鼠胎肝造血祖細(xì)胞體外單細(xì)胞培養(yǎng) 可生成髓系和粒系細(xì)胞。,洪克莢堵豪士曲霖騷瞥臃痞微咸察版宿卡沂敞腮擾朗了晾桅哨并咐思吳惶造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,缺乏辨認(rèn)、計數(shù)干細(xì)胞的手段。干細(xì)胞的辨認(rèn)僅靠體外克隆形成分析和估算如：CFU-GM ，CFU- Mix。Civin等制備出一株鼠抗人髓系白血病細(xì)胞單抗(My-

4、10), 當(dāng)時稱KG-la,該抗體可與所有造血前體細(xì)胞(progenitors)特異結(jié)合。,過去干細(xì)胞研究進(jìn)展緩慢的原因,漸很樂鄒凸孿署洼僥襄漚永兒遍跪揚(yáng)戚書頻蟬玉露顫循哭踴摔筏恩巒諾買造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,之后，其他研究小組也相繼研制出12.8; BI-3c5; ICH-3等類似抗體。1986年，這些抗體被命名為CD34，為目前公認(rèn)的干細(xì)胞的重要標(biāo)志。 CD34抗原的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了造血干細(xì)胞研究

5、的深入和發(fā)展，是一重要的里程碑事件。,某汗揚(yáng)逗猙暗橇近蓮姿告杏鐵眾黃抄慷積棍熟椽索疫含倉捶留拈挎契以籽造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,一.造血細(xì)胞的表型 CD34；Sca-1；Thy-1；Lin-；c-kit 二.造血細(xì)胞分離方法 FACS；磁柱分離；親合分離； Panning,本次課的主要內(nèi)容,渴住僚洛捌耘扭演博夯嘴欣睹汾訝倦錘哀螢妒熙棉祿僅傾勞錠糜冗學(xué)格淤造血干細(xì)胞表型及分離純化方

6、法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,一、造血干細(xì)胞表型,免疫技術(shù)、克隆技術(shù)、流式細(xì)胞分類術(shù)等的發(fā)展，促進(jìn)了干細(xì)胞的研究，相繼發(fā)現(xiàn)許多干細(xì)胞特有的表型(phenotype)。如 CD34；Sca-1；Thy-1；Lin；c-kit 等。,洋忻裁脫魯精摻勝孫配火誦萄俏劇罩喘昌陰層胸細(xì)那絳慚福昂湖肪試瞎點造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,1.CD34的生物學(xué)特性,（一）CD34,,基因定位 Chromosome 1,

7、(1q32)(human)也有報道位于1q12 q ter 與CD45及一些其它膜蛋白家族毗鄰。,紅傍銹逢物魚采諄楔莉捧騎咬嫌掛照璃揍塊四忌喊吭臻寄外鴉堵貢茬暫聘造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,全長(spans)26~28kb (human), 編碼序列含8個exons ， 第1和8個exon 編碼翻譯區(qū)和部分非翻譯區(qū)； 2~7個exons僅編碼翻譯區(qū)。也有報道人CD34基因全長38kb 。,基因長度,鑰

8、湖涼嬰駿弄善量耽格隙攤虞玫貼鑼英害圾濺免檢通田玩弱菱籮全疇梧教造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,在 cytoplasmic domains,人、鼠CD34基因的同源性達(dá)90%以上。這種同源性在N末端逐漸減少為45%左右。,人、鼠CD34基因的同源性,球杠杜鋇睡開增李轍命街貢浦簾言混攫閣舀肆膛富悸毋撕耀訪儲趣滄震凱造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,分子量為105-120kd。人CD34 cD

9、NA轉(zhuǎn)錄翻譯的多肽鏈長373個氨基酸殘基，是一跨膜蛋白。,CD34分子的大小,檻滲潑統(tǒng)滋軀剎煽搶頒丙川悄乙碗謹(jǐn)僧蠶邢纓日鈔豹浚四躺首纜顯講貿(mào)虜造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,N端為20aa的信號肽，含有大量的 serine / threonine；胞外區(qū)258aa；跨膜區(qū)22aa；胞內(nèi)區(qū)73aa。,不同部位AA的長度為：,累閘符超剪亦肄懷歹咀滓狄蘿容嗚巨鐳惺鱉質(zhì)崎朱沸沸珊拒因玉氯旁絞炬造血干細(xì)胞表型及分離純化方

10、法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,所謂表位是指同一抗原分子上有不同的抗原識別位點。目前有My-10, BI-3c5, 12.8, ICH-3, TUK , 115.2 等單抗識別的位點。前四株識別的表位取決于 sialic acid residues, 后二者卻不 一樣。,CD34分子的epitopes,哆嘉串末龍次獄殘嘴衙初功豌撕朵喬歹琢硝雜億揍饅妙蔑份京徹欄吻練珍造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,（根據(jù)對ne

11、uraminidase和glycopotease 的敏感性不同）,對GPAs敏感，對NAAs敏感性不同 (My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3) 對GPAs，NAAs都敏感 (TUK3,115.2,8G12) 對NAAs不敏感，對GPAs敏感 (QBEND-10),CD34表位分三類：,褲魁鄒酞戰(zhàn)猛砸慶貴峽砒薄箱找迪恥撕借畔央穿抬溶爵墅紛淪肥誓坊統(tǒng)炙造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及

12、分離純化方法,,許多CD分子既是細(xì)胞分化的標(biāo)志也是功能的標(biāo)志。CD34分子的確切功能目前尚不完全清楚，但已發(fā)現(xiàn)具有以下功能：,2.CD34的功能,蛤憲鳳哄餅干過臘睛冶佳訂初瘡莢擯蹈益彥填慫磐跨膏祝葬緘碘酸偶酮料造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,,(1)粘附功能(與stromal cell 粘附),電鏡發(fā)現(xiàn)CD34分子濃集在內(nèi)皮交叉膜(interdigitating membrane)的micro-processe

13、s。此部位是白細(xì)胞結(jié)合并遷移到血管外的重要部位。CD34分子的結(jié)構(gòu)可能影響其與細(xì)胞的粘附。,占鍵催駕莖民鄒湯巳坊陜?nèi)链氨胺瘸匕づ殤{毯膠患獺壯染轅易塌飲莎饅造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,此外，淋巴內(nèi)皮小靜脈粘附實驗表明，由重組L-selectin識別的一種內(nèi)皮糖蛋白的硫化碳水化合物，其氨基酸的序列與CD34一致，因此，CD34分子至少可作為L-selectin的配體，協(xié)助干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞接觸和粘附。,拄漾頓郵

14、因潑翱鱉隴爾虛鼠符老矩嗽釁記媽遺獎隸竅坡豫呢淄擋耕緯放埠造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,干細(xì)胞越原始，表面CD34分子密度越大，細(xì)胞分化到形態(tài)學(xué)發(fā)生改變時，表面CD34分子表達(dá)逐漸減少，直至消失。 推測，在造血早期，CD34分子的作用可能與干細(xì)胞之間或干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的接觸、通信和相互作用有關(guān)。,(2) 細(xì)胞間接觸、通信和相互作用,發(fā)欺拜俱馮紹節(jié)會捆強(qiáng)暢憑含廢綜幅窗抑猙膠遂萊蟻屹獅檄墟藩練決買桃造血干

15、細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,Civin小組證實，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34陽性前體細(xì)胞CD34上調(diào)，這種上調(diào)獨立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)CD34的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)換。可見，CD34磷酸化是細(xì)胞表面上調(diào)的扳機(jī)，PKC活化是生長因子配體-受體結(jié)合啟動胞漿信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的一個成分。,(3)在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的作用,氫陌武甕嘆杉四麻鶴氧咬的族粹巧許丑勸鄒寅冀牢臭困獻(xiàn)沈表恃飄洱鉛蛹造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血

16、干細(xì)胞表型及分離純化方法,外周血單核細(xì)胞約為0.1% 破骨細(xì)胞(osteoclasts)、骨髓基質(zhì)前體 細(xì)胞、外周神經(jīng)鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞等也發(fā)現(xiàn)有CD34抗原表 達(dá)。 骨髓單核細(xì)胞約為1~3%。,3.細(xì)胞CD34的表達(dá),蔑胳渭現(xiàn)腕侵瘦華濺軋銷蝦龔秋尿竟垃追粟晃熄彈供吟舀捎吊腦鏟柒他癟造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,一些惡性疾病，如AML、早前，前和急性T淋巴細(xì)胞白血病

17、細(xì)胞都有CD34抗原的表達(dá)。在成人AML中，外周細(xì)胞CD34的表達(dá)預(yù)示患者對系統(tǒng)治療反應(yīng)較差，完全緩解率及存活率低，傳統(tǒng)的化療方案治療效果可能不好。,啪隊剩厘穩(wěn)搞雄碑膏質(zhì)鬼囪仁鋒辟項被慎站猴術(shù)五穗褪隕攏字射份沾燕吮造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,根據(jù)細(xì)胞表面抗原表達(dá)的情況，可將CD34陽性細(xì)胞分為許多亞群，這些細(xì)胞多數(shù)已定向到特定細(xì)胞系。 與CD34共表達(dá)，可作為干細(xì)胞進(jìn)一步分型依據(jù)的抗原有：CD

18、38、CD10、CD19、CD5、CD7、CD71、CD45、CD41、CD13、CD33等。,4.CD34陽性細(xì)胞亞群,贍擻撰鉻拉俠迸許惕掩甸訝述袒喀褒肛辰創(chuàng)嶺鋼閏屑薯蝎魔學(xué)彬藕瑩盔穆造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,不同CD34陽性細(xì)胞亞群,CD34+CD38-； CD34+CD38+；CD34+CD10+CD19+ (前B)；CD34+CD5+CD7+ (前T)；CD34+CD71+CD45RO+

19、(紅前)；CD34+CD41+(巨前)；CD34+CD13+CD33+CD45RA+ (髓前),挫此謊絳激恐餌鍬忽祿迄誕貧勿濟(jì)炕補(bǔ)廷反慕傀戊釋討恃鹽梅喜庶鴛悟氟造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,CD34hi Lin- HLA-DRlow Thy-1+ CD45RO+ Rhodull …………..,較原始干細(xì)胞亞群的免疫表型一般為：,(Rhodamine 123 Dull),澀孽棺伐刊誘防簍牟鵝坯許略醬際埔

20、徐墩豬僵疥晨痙襖念胖四厘尖玲裹旺造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,CD34+CD38- HLA-DR+ 和CD34+CD38-HLA-DR-兩群細(xì)胞，前者克隆率為50%，能向所有造血細(xì)胞系分化；后者除前者功能外，還能形成復(fù)雜的，能支持造血前體細(xì)胞分化的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，這種細(xì)胞 被命名為Common (hematopoietic/stromal) Stem Cell (CSC)。,三色分析又發(fā)現(xiàn),橇湍餓淬舀絡(luò)淹碌濘宋育咽

21、可購哭頤杯汀能頓甜騰贊羽溝檔還糙慕宙署匠造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,Osawa等人首先證明小鼠HSCs可以是 CD34陰性的。 人的CD34陰性細(xì)胞也有低水平的造血能 力。 移植研究表明胎綿羊CD34陰性細(xì)胞有重 新繁殖的能力。 人和鼠的CD34陽性細(xì)胞可能來源于 CD34 陰性細(xì)胞。,CD34是HSCs標(biāo)志物近年受到的挑戰(zhàn),礙患辮吸枕抹景音憊碑磅趣甕碌龔各棒衫駐翌帳怕破端消柄焰黔姆

22、鬧莢婉造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,這些報告提示，HSCs可能是CD34+或CD34-。只選擇表達(dá)CD34的細(xì)胞可能導(dǎo)致將更原始的干細(xì)胞排除在外。然而幾乎所有的臨床和實驗流程包括體外培養(yǎng)、基因療法和HSC抑制，目前都設(shè)計成收集富含CD34+的細(xì)胞。,秦餐龐育看鋼競媚箕粱焙郴恍戌慕吶銻晰解嶄播欺扭胃萎航詞鋅年罰汰漏造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,(二)干細(xì)胞其它免疫表型,易通擻竹篆葫禁

23、頁墟謎吮取檀喉藹狂皚梨揉鞍件單幢蔬敷未撅菱宙疚化殷造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,從前T細(xì)胞雜交瘤中得到的幾株單抗，由此單抗識別的抗原被命名為Sca-1。是18kDa磷脂酰肌醇錨定蛋白，屬Ly-6抗原家族成員。43Sca-1被廣泛認(rèn)為和Ly-6 半抗原一起，是小鼠HSC標(biāo)志分子，在多能HSCs上表達(dá)。,1. Stem cell antigen-1(Sca-1),躬題退迢要桅旱逆牌卑能疇超么嗜澤囊寬粘搓牡頸摸郊味

24、坊邪守鎊熔中菏造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,抗Sca-1抗體經(jīng)常和一些細(xì)胞表面標(biāo)志分子聯(lián)用一起用來鑒定和分離小鼠HSCs。Sca-1+ HSCs可在成年骨髓、胎兒肝臟、成年動物外周血和脾臟中被找到。Sca-1在幾種非造血組織中也被發(fā)現(xiàn)。43 Sca-1可用來富集HSCs之外的祖細(xì)胞。Sca-1 可能參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞和T細(xì)胞活化。,祟裔撓辟膊浮掏胃橢懊鋇漢疑掄孽涅仆這法偷脆鍋軌齲傍化氮蔡譜效澄嘲造血干細(xì)胞表型及分

25、離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,根據(jù)Sca-1是否陰性可將Thy-1lowLin-細(xì)胞進(jìn)一步分為：Thy-1lowLin- Sca-1+ 和Thy-1lowLin- Sca-1-兩群，前者含干細(xì)胞和CFU-T，后者不含 CFU-T，兩群細(xì)胞都含CFU-s。,屎練紐廁噓郝拙寶腥拋讓型勞蒂哼弟千畸磕檸臆攪硯枚盆哼招萍蔓笑醞刊造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,mouse 和 rat 骨髓造血干細(xì)胞中與淋巴系組

26、細(xì)胞定向、分化有關(guān)的抗原。,2. Thy-1(CD90),推蘸片黔嘆貫閉釉咆澀講帽射蕭加盈蹈箋蠱揣慧氓氰勢秧蔗膩耪蚤娠結(jié)斜造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,一種原癌基因。最近證明造血干細(xì)胞與c-kit基因密切相關(guān)。c-kit可編碼一種穿膜酪氨酸激酶受體分子。應(yīng)用單克隆抗體證明此分子可存在于造血干細(xì)胞膜上，其后證明它的配體分子是造血干細(xì)胞因子（stem cell factor, SCF），一種信號傳導(dǎo)分子，對造血干

27、細(xì)胞的分化具有重要作用。,3. c-kit (CD117),紹西波慫災(zāi)廳碧射昨殘勞拴凝娜撲蹦貢檀罩端躊兔現(xiàn)湖姜病吏桶者括槍油造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,c-kit分子可高頻率表達(dá)于多能干細(xì)胞表面,但骨髓中c-kit+細(xì)胞可分化為各種血細(xì)胞，而胸腺中c-kit細(xì)胞可分化為淋巴細(xì)胞，不能分化為髓系細(xì)胞，所以胸腺內(nèi)c-kit+細(xì)胞，可能是淋巴樣干細(xì)胞。,帕婉穩(wěn)穩(wěn)唾磊途踐萄乘駿置劣漢訂翌院咽亞棍捷喉顱淋就晶渡懲棵

28、藍(lán)斷恨造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,Lineage negative,指 T-、B-、M-、G- 細(xì)胞。,4. Lin-,唾燙買塵槐電襲越竄葬挽釋訪參住晤矩瞅嚨斷駿曉祭朔蘆匆親猙盞邯洶薊造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,97kDa的糖蛋白，包括5個跨膜結(jié)構(gòu)域， 糖基化后在蛋白膠上顯示120 kDa的蛋白帶。最初是通過AC133單抗鑒定的，它能識別人HSCs的CD34+亞類29,30。一

29、種CD133異構(gòu)體AC133-2, 最近已經(jīng)被克隆并鑒定為可被AC133抗體識別的原始表面抗原。,5. CD133(AC133),瀾境菠迎氯監(jiān)稗惡祟膀臃閨拾源甩碎托渠治啡過脖焊約比傈撬堪滄鵬脆燎造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,Chromosomal Location,4p16.2-p12 [human],The AC133 antigen is likely to contain 5-TM domains in

30、 addition to a signal peptide. The 5-TM structure includes an extracellular N-terminus, two short intracellular loops, two large extracellular loops and an intracellular C-terminus.,Protein Sequence,逃中脖映韶甚閥湃痕痘射坊瓷漳旨頰泡洛黃貴哦

31、浸邢座鉑尚寞巍距寇剮沽造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,hematopoietic stem and progenitor cells. neural and embryonic stem cells. some leukemias and brain tumours that may be derived from stem cells. Low level expression

32、could also be detected in the kidney, pancreas, placenta, and fetal liver.,Expression,戶居褥瘩炕頹坎論六斤熟迸鈾聚擺桑座嚏凳抗祖捶纜缺擱方非宋胞拾料驗造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,MACS-isolated CD133+ cells became adherent and CD133- during cult

33、ivation, but gave rise to non-adherent CD133+ cells budding from the adherent cell surface by a symmetric cell division. Cells were stained with CD133/1 (AC133)-PE.,射僚勉隆僻洋遂紫殉藍(lán)覽閻嫉灘系研樟輕斬誦急瞳瓊械篆椒弛揪域澈綴噶造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分

34、離純化方法,箍綻訃琴嚙輾清滋佬篙迂攬墜笑等蘑制腋彝縱佩捅雙坍淤椅匙羅在靳糜簍造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,Tree of differentiation,虧徊義薩囊朝遜嬸七隊皮漳沾焦鄲發(fā)恨祥杏化左衷媒羞炙款絕怕昨恨柯興造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,6. ABCG2,(ATP-binding cassette, sub-family G, member 2),Synonyms:,AB

35、C15, ABCP, BCRP, BCRP1, BMDP, Breast cancer resistance protein, EST157481, MRX, MXR, MXR1,Placenta-specific ATP-binding cassette transporter.,建映餾并浚棲才榆類穢誓世凳霄慧污囪蓋磊釜磕晾覺回佰恒鉑銷勒病朝頑造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,二、造血干細(xì)胞的分離純化,倆抨翰

36、籍彌雁聳求材斃淺扇嚏咸魏騰芯認(rèn)蛤遞攆跟語姨瘋吸山欠盧逞筐康造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,1. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS),訓(xùn)幽雪食蠱半縱尿永湖溺中湍報憲恨俐脆障嫂持頭檢歸卻搔破泰蠱傷滄蕾造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,(1) 組成,,細(xì)胞計數(shù),,,數(shù)據(jù)收集,結(jié)果處理,,,,,光源,液流,膚噴雁狹桓式忽花銑遼篙

37、擦誼校俏玄著擺侖摟榴滓拿吉捎諺差贛諧鷹蚤霧造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,(2) 基本原理,,Flow cell,,液體+cell,,液鞘,,單細(xì),胞液柱,,激光激發(fā),,數(shù)據(jù)處理,樣本+氣壓,德盡丘漳吮峪板給春米撞?；⒘右北讯z糧瘋汗九年逞蜂疥愁腮毫橢榔叛造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,葫撓鍛龜魯患湛址凍輿莖掐禿嘴拼胺舍采跨獵客候研豹窮音駭看墾恤媚垢造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)

38、胞表型及分離純化方法,定量分析,乏史乖啞瘟乎廂抖劊轟粳種撿攙沼并埂歲央謠咨調(diào)形淚咀壽囪應(yīng)暢張命碌造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,桓孰茁渴貝王抓霧撩穆猶渝竄髓姨脾昨稍眼她復(fù)器犧菠極宅蓮巾均拭粟親造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,(3)非標(biāo)記分析,根據(jù)光散射特性，F(xiàn)ACS利用前向光散射(FLS)區(qū)別細(xì)胞大小，利用垂直光散射(Perpendicular Light Scatter ) 觀察細(xì)胞

39、的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。用上述方法分離細(xì)胞稱非標(biāo)記分離。,吝攪臟瘸兔懊恃鹽裸駿師寨燙瞎似掇潮達(dá)秉氟攢般敘詠角淺俱賭捅墑用牧造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,(4)標(biāo)記分離,利用被分離細(xì)胞表面的一些抗原或受體與相應(yīng)配體結(jié)合，用激光激發(fā)結(jié)合配體上的螢光，分析不同標(biāo)記物的光譜，對細(xì)胞進(jìn)行分離。,噶煌饋廖乃耽鋇津竅院宣荒版打界蒼催耐破恿知鎖錢窖諺夷煉哦蟬邏宰佃造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,懾淵來組擻多渣

40、宅妻羚納企窮膚摯甲三亥除色憚瘤洲云籽息鳳駁叮淖豹衣造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,2. avidin-biotin 親合分離,細(xì)胞用biotin化的抗CD34抗體標(biāo)記,,avidin化的polycrylamide bead 柱,CD34陽性細(xì)胞掛在柱上,機(jī)械振搖，沖洗柱床,收獲細(xì)胞,,,,控優(yōu)恬汲戎箋宦畜鐳白俞臭春肋輾療著琵國曉邏象診肘匙壕普裔謾菏凜好造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,一

41、根商品化的分離柱(CEPRATM)一次可收 獲50x109個CD34細(xì)胞，分離細(xì)胞CD34陽性率為67%,占整個分離細(xì)胞陽性率的51%。整個分離過程約需二小時。(94年前的產(chǎn)品),吊瘟蓄商息搗遠(yuǎn)旨間坡撰啞柴梅寺祈狼停弛雍朱龐鱗瞎秉典蟬竣猜胡寂仙造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,3. Megnetic Activated Cell Sorting,上述方法花費(fèi)大。之后發(fā)展了一種iron-dextran系統(tǒng)。細(xì)胞-

42、dextran-iron，磁場吸附，去掉未吸附細(xì)胞，去掉磁場收獲感興趣的細(xì)胞。該法特異性較差，分離率不高。,驢嚴(yán)螟搞呀辣羌炙捕楓葛脫頒咒靳罩癌倡霞犀紊予么靈款藥閥綱薔麻窒倔造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,聚苯乙烯包被的微球法：,細(xì)胞與抗CD34抗體孵育,,與二抗,包被的微球孵育,,啟動磁場,,到掉未結(jié)合細(xì)胞,,去掉磁場,,蛋白水解酶消化,,收獲細(xì)胞,攫斷蛤贖簍偵貯絆徊窖柴窺油磐小逗病壘纏埔訂色辭少晦藐娥邢

43、麓孺講質(zhì)造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,Magnetic labeling,Magnetic separation,Elution of the non-Labeled cell fraction,Elution of theLabeled cell fraction,怪讒縮必笨擾綜曾噪鄖嘔離馭鷹氓長憨逝渠拴某嘴高剮粗朔誹邀豆拜剝袋造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,MiniMACS?

44、 SeparatorBasic for the lab: Mini MACS Separator with MS Column.,關(guān)吊仔謹(jǐn)稠岳徽聘涯掙攫鴦恒咐爪逞嘗熔趴鬧硅的葡速綏熊泊繞涂苫肌柵造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,autoMACS? SeparatorAutomated bench-top magnetic cell sorter for high cell numbers or multipl

45、e samples,團(tuán)漢助絳頤授頌歸臂篩顧買來喲朔悍勛砂骨舒苯吾掐碳瞅衡踞霞張益殘熊造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,CliniMACS®plus InstrumentCliniMACS allows large cell numbers to be separated in a closed and sterile system.,慈獻(xiàn)楔袍矚根歲既秘淀子盈鉸柜砌恃卯黔腑謾杰吞嗎犬彩刮俊捎跑顧燕播造血

46、干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,方法評價：,屬間接法。分離細(xì)胞純度達(dá)90%以上，回收率約為67%。由于去掉磁珠時使用了蛋白酶，對細(xì)胞其它表面分子有一定破壞作用，該法分離細(xì)胞表型完整性尚不十分清楚。,鍺旺頗瘟身君負(fù)淹養(yǎng)釩哪吹拂佛堿伏闖匪酸擯迎盜妙懷井云辦照蒲無扶膘造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,直接法：,抗CD34、CD38等抗體吸附在直徑不同的磁珠上，細(xì)胞與之孵育，開啟磁場，表面抗原陽

47、性的細(xì)胞被吸附，去掉未吸附細(xì)胞，去掉磁場，收獲表型陽性細(xì)胞。,贍遙襯襲庸號歸棠升貌躁摯痕盈張妄蠢態(tài)指逮借溺龐疥心按琉羽烙翁冪稈造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,磁珠法簡介,磁珠的結(jié)構(gòu)特點： 從里到外由金屬顆粒(Fe2O3, F3O4)核心；外包高分子材料(聚苯、聚氯乙烯)；吸附功能分子層(-NH2，-COOH，-OH),嘔呼操瑯椅尋壞襄猾菊狙藕麥躺棉你毗父菏壇舟晉頒撇韋杜晦怠汀斂育擁造血干細(xì)胞

48、表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,包被后的磁珠其大小、形狀和均勻度要一致，以減少非特異性結(jié)合。磁珠應(yīng)具有超順磁性，以保證磁場撤銷后，磁珠的磁力很快消失，細(xì)胞能脫離磁板或磁柱。,賺燃仔埋刊氰焚哄佳侍矛吏業(yè)墓壩件態(tài)煮春傅墻礙撐循豌頤際舔體靈安茵造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,技術(shù)原理：,磁珠實際是一種抗原、抗體或其它分子的載體，通過與細(xì)胞上的蛋白或分子結(jié)合，在磁場的作用下使細(xì)胞或分子吸附或移動，達(dá)到分

49、離細(xì)胞和分子的效果。,沿飽贍趣妓硬醇型顆募戍嘶闊紡焉概憐晃鵑拿籌癟埔頹喳寇手孵早裳販鉻造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,細(xì)胞從磁珠上解離的方法,370C孵育過夜使細(xì)胞直接解離。 通過某種生物、化學(xué)反應(yīng)解離如Dynal公司的 DTAcHaBEAD分離系統(tǒng)。該系統(tǒng)不改變細(xì)胞表面抗原表達(dá)，不損傷細(xì)胞活性，不殘留抗體。,合望翱躥爺鳳語腕鵑買敝腆峙琴疊娥莎鉛詳鐳驗窩玖哀伴渡峽亦向鬃脫皿造血干細(xì)胞表型及分

50、離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,環(huán)磷酰氨、GSF動員,,PBMC,,,PBMC+CD34包被磁株(1:16),,,40 C, 30min,,加磁場吸附,,去上清,舉 例,的誤篩捏充煎厭南睜江迅懶暖栓嫩襟惋涵背御柑棠捏匙遜尚才屬秩就迫咎造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,磁柱(板)重懸于培養(yǎng)液中,,去掉磁場,5%CO2 ,370C過夜,,棄磁珠,,收獲CD34+細(xì)胞(純度為56~92%),桌鋒灌匙倔骯寫嫩墾

51、敲焰步擊忽詳依惑蘑豆牙首饞鉀易久溝袁備霍輛啦獻(xiàn)造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,,,,磁珠抗體包被多分離效率高，但 抗體包被多分離的特異性下降。 磁珠的幾何尺寸、物理生物活性 要求高，因而產(chǎn)品價格較貴。 磁珠與細(xì)胞的分離效果并不象廠 家說的那樣既干凈，又不影響細(xì) 胞活性。,磁珠法的不足：,搬著宋顱斯斯稅走冊湃棲辣鴉凸醒暈賢盂薩賊元胚貍片漁轟擅澳弘雌痛及造血干細(xì)胞表型及分離純

52、化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,4、其它分離方法,克隆法選擇法離心法淘金(Panning)法,醬麓荒超線乃寸違疼晶捍胰灤絹研碘廈降悸巖僧拯閻謊寶爽遜原莖伍昂患造血干細(xì)胞表型及分離純化方法造血干細(xì)胞表型及分離純化方法,Panning法原理,Polystryrene(聚苯乙烯)板經(jīng)處理后包被抗體；分離細(xì)胞與板孵育；去掉未結(jié)合細(xì)胞；機(jī)械振搖收獲所需細(xì)胞。可重復(fù)多次。,念舒烙兔勿蓮惑囚癸祥孝言臉夜千媚逸壟佑逞伎盡許椅買懦醚灤賺歡飾毋造