梅毒檢測ppt課件

1、梅毒實驗室檢測技術(shù)與評價 貴陽市疾病預(yù)防控制中心 謝 芳,,,學(xué) 習(xí) 內(nèi) 容,一、梅毒的現(xiàn)狀及定義二、梅毒螺旋體的生物學(xué)特性三、梅毒實驗室檢查方法四、梅毒血清學(xué)診斷試驗五、梅毒血清學(xué)試驗的結(jié)果解釋六、梅毒實驗室操作要求七、存在的問題,一、梅毒的現(xiàn)狀及定義,一、梅毒的現(xiàn)狀1、近年來我國嚴(yán)峻的梅毒流行形勢（梅毒實驗室檢測不規(guī)范現(xiàn)狀）。2、今年衛(wèi)生部出臺梅毒10年控制規(guī)劃

2、（梅毒血清學(xué)檢測、新方法、新技術(shù)的應(yīng)用性評估）3、目前我國僅對首次就診的孕產(chǎn)婦制訂了梅毒篩查方案，即：首先采用非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗或梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗之一進(jìn)行初篩，當(dāng)篩查結(jié)果為陽性時，需用另一類試驗進(jìn)行復(fù)檢。對一般人群尚無明確的篩查診斷流程。二、梅毒的定義梅毒是一種全球分布的系統(tǒng)性性傳播疾病。梅毒的病原體是蒼白螺旋體（Treponemia pallidum，TP）。人是梅毒的唯一傳染源，主要傳播途徑主要有性傳播、血液傳

3、播和母嬰傳播3種，可侵犯人體全身器官，臨床表現(xiàn)分為一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潛伏梅毒，既能產(chǎn)生各種各樣的癥狀和體征，又可多年無癥狀而呈潛伏狀態(tài)，對人類健康危害極大。,二、梅毒螺旋體的生物學(xué)特性,1.長度為8μm～20μm，平均8μm～10μm，直徑<0.2μm,有 6～12個螺旋。2.因其透明不易染色，故稱為蒼白螺旋體。3.梅毒螺旋是一種小而纖細(xì)的螺旋狀微生物。4.梅毒螺旋體的特征是螺旋體整齊而規(guī)則，折光性強(qiáng)，較其他螺旋

4、體亮。5.運動緩慢而有規(guī)律，具有三種特征性運動方式：常見是圍繞其長軸旋轉(zhuǎn)前后移動；其次是全身彎曲如蛇行；少見的是伸縮其螺旋間距而前進(jìn)6.梅毒螺旋體至今還不能在人工培養(yǎng)基上生長繁殖，目前只能將其接種到兔睪丸內(nèi)增殖、傳代和保存。以橫斷分裂的方式進(jìn)行增殖，世代時間為30小時～33小時。7.梅毒螺旋體在體外不易存活，煮沸、干燥，一般的消毒劑如汞劑、石炭酸、乙醇等很容易將其殺死。在41℃～42℃時經(jīng)過1小時～2小時也可將其殺死。8.

5、低溫（-70℃～-196℃）下可保存數(shù)年并保持其形態(tài)、活力及毒性。,三、梅毒實驗室檢查方法,梅毒的臨床實驗室檢測方法較多，概括起來分為梅毒的病原體檢查、梅毒的血清免疫學(xué)檢查和梅毒的核酸檢查3大類。,（一）病原體檢查方法,即梅毒螺旋體檢查，采用暗視野顯微鏡檢查或直接免疫熒光試驗(direct fluorescent antibody test，DFA)，在顯微鏡下觀察梅毒螺旋體的特征性形態(tài)和運動方式。該方法是診斷早期現(xiàn)癥最直接的方法，但由

6、于受到患者用藥、檢測儀器狀態(tài)和檢測人員技能等條件的制約，本方法實際檢出率并不高。未檢測到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。本方法費時費力，也不適用于梅毒的大規(guī)模篩查。,（二）血清免疫學(xué)檢查方法1,1、非梅毒螺旋體抗原試驗 檢測患者血清中宿主針對機(jī)體組織破壞后暴露的脂抗原或者螺旋體表面的脂質(zhì)產(chǎn)生的非特異性抗類脂抗原的抗體(反應(yīng)素)。檢測方法包括：快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗RPR)；甲苯胺紅不加熱血清(TRUST)；性病研究實驗

7、室試驗(VDRL)；不加熱血清反應(yīng)素試驗(USR)。目前最常用的是RPR和TRUST。 由于在治療過程中反應(yīng)素滴度可呈動態(tài)變化，非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗常用于臨床療效觀察、復(fù)發(fā)或再感染的檢查。同時，由于該方法操作簡便、快速，成本低，特別適合基層應(yīng)用和人群調(diào)查。此類方法的缺點是反映不出既往感染，并且受其他疾病影響較大，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果,（二）血清免疫學(xué)檢查2,2、梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗 目的 檢測梅毒螺旋體Ig

8、G、IgM抗體。 檢測方法包括：梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA）梅毒螺旋體顆血球凝集試驗（TPHA）梅毒酶聯(lián)免疫吸咐試驗（TP-ELISA）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒快速檢測（TP-RT）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（TP-WB）。 梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗的共同優(yōu)點是特異性強(qiáng)，可以作為非梅毒螺旋體抗原試驗初篩陽性標(biāo)本的復(fù)檢或確證試驗 ，但是，由于感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者長時間甚至

9、終生陽性。所以這些方法不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。亦不能作為療效觀察的指標(biāo)。,（三）梅毒螺旋體核酸檢查,可對血漿、血清、皮損部位組織液、淋巴穿刺液及腦脊髓液等標(biāo)本的梅毒螺旋體核酸采用PCR進(jìn)行檢測。核酸檢查的優(yōu)點是特異性高，在早期梅毒、神經(jīng)梅毒、先天梅毒和伴艾滋病梅毒等診斷中，以及螺旋體現(xiàn)癥感染和既往感染的鑒別診斷中具有一定的價值，也可應(yīng)用于梅毒螺旋體的耐藥性監(jiān)測、菌株流行病學(xué)分型。該方法缺點是成本高，對實驗條件要求高并且易受多種因素影

10、響，不宜做療效觀察。,四、梅毒血清學(xué)診斷試驗,目前，梅毒的實驗室血清學(xué)診斷技術(shù)是檢測梅毒螺旋體抗體主要方法有兩類： 1.非梅毒螺旋體血清試驗 2.梅毒螺旋體血清試驗,（一）非梅毒螺旋體血清試驗1,非梅毒螺旋體抗原試驗 ：用心磷脂、卵磷脂、及膽固醇做抗原，檢測宿主對梅毒螺旋體表面的類脂物質(zhì)所產(chǎn)生的IgG和IgM抗體（抗心磷脂抗體，反應(yīng)素 ﹚包括VDRL、USR 、RPR、TRUST試驗等 性病研究實驗室玻片試驗（VDR

11、L）：屬于沉淀反應(yīng)，目前應(yīng)用最廣泛。用心擬脂、卵磷脂、膽固醇為抗原，可作定性和定量試驗，操作簡單，費用低，常用作大量病人的篩選及療效觀察。但在一期梅毒時敏感性不夠高，以及弱陽性時判讀結(jié)果困難為其缺點。 　血清不需加熱的反應(yīng)素試驗（URS）：此法在國內(nèi)已逐步推廣使用，也是一種非螺旋體抗原原血清沉淀試驗。其原理是在VDRL所用抗原中加入了EDTA（乙二胺四醋酸）和氯化膽堿，使操作更為簡單，更便于讀結(jié)果，其敏感性與特異性和VDRL相同。

12、 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR):此試驗是VDRL試驗的一種改良方法。該法是在抗原中加入活性炭顆粒作為指示物，加入了氯化膽堿，因此血清不需滅活。特制的白色紙卡替代了玻片。試驗結(jié)果易于判斷，肉眼即可觀察。也可用血漿進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果可保存。抗原放4℃冰箱可保存1年。,（一）非梅毒螺旋體血清試驗2,臨床應(yīng)用價值：簡便、快速、敏感性和特異性較好可用于大規(guī)模的人群和產(chǎn)前篩查指示目前疾病的活動程度可作定量試驗，用于療效觀察，早期梅

13、毒經(jīng)有效治療后，抗體滴度會下降，並轉(zhuǎn)為陰性，如抗體滴度不下降或下降緩慢或下降后又上升，說明治療失敗、復(fù)發(fā)或再感染。晚期梅毒可自然轉(zhuǎn)陰。,材 料(以RPR為例),RPR試劑盒：含RPR抗原；直徑為18mm圓圈的特制白色反應(yīng)卡片；標(biāo)準(zhǔn)針頭（60±1滴/mL）；RPR試驗結(jié)果圖片。　　其他：水平旋轉(zhuǎn)器。,定性試驗,a. 吸取0.05 mL血清或血漿加于卡片圈內(nèi)，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)（每張紙卡有10個或12個反應(yīng)圈）；　

14、　b. 將抗原輕輕搖勻，用標(biāo)準(zhǔn)針頭吸取抗原，每個標(biāo)本加1滴抗原；　　c. 將卡片置水平旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)8 min；　　d. 立即在明亮光線下觀察結(jié)果。 結(jié)果　　中到大的黑色絮狀物，液體清亮 3+~4+ 強(qiáng)陽性　　小到中的黑色絮狀物，液體較清亮 2+ 陽性　　小的黑色絮狀物，液體混濁 1+ 弱陽性　　僅見活性炭顆粒集于中央一點或均勻分散 － 陰性,定量試驗,RPR定量試驗與TRUST試驗相同。 a.在圈內(nèi)加入0.05 mL等滲鹽

15、水（一般作6～8個稀釋度）勿將鹽水涂開； b. 吸取0.05 mL血清或血漿作系列稀釋（1:2～1:64），當(dāng)稀釋到最后的第6孔時，棄去0.05 mL稀釋液。從第6孔起將血清稀釋液涂布整個圈內(nèi)，再涂布第5孔，依此向前到第1孔。 c. 滴加抗原，旋轉(zhuǎn)時間、速度和觀察結(jié)果同定性試驗。,RPR試驗結(jié)果,（二）梅毒螺旋體抗原血清試驗,梅毒螺旋體血清試驗方法有: 1.TPHA(梅毒螺旋體血凝試驗) 2.TPPA（明膠顆粒凝集試驗

16、） 3.FTA－ABS（熒光抗體吸收試驗） 4.TP-ELISA（免疫吸附試驗） 5.TP-WB－TP和TPLA（蛋白印跡試驗） 方法簡便，結(jié)果易讀，適用于大量標(biāo)本的檢測。 FTA－ABS試驗是“金標(biāo)準(zhǔn)”試驗，具有敏感性高，特異性強(qiáng)等特點。不能作為觀察療效 優(yōu)點：特異性高， 對非特異性試驗進(jìn)行證實 缺點：不能區(qū)分是新發(fā)感染或治療后， 通常終身持續(xù)陽性,,梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）原理:TP

17、PA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)。明膠顆粒為玫瑰紅色，便于肉眼觀察結(jié)果。,材 料（以TPPA為例）,a. TPPA試劑盒：含蒸餾水（標(biāo)記A），用于溶解致敏顆粒、未致敏顆粒和質(zhì)控血清；標(biāo)本稀釋液（標(biāo)記B），用于稀釋血清標(biāo)本；致敏顆粒（標(biāo)記C），冷凍干燥品，用前30 min按規(guī)定量加A液溶解并混勻；未致敏顆粒（標(biāo)記D），冷凍干燥品，用前30 min按規(guī)定量加A液溶解并混勻；

18、質(zhì)控血清（標(biāo)記E），冷凍干燥品，用時按規(guī)定量加入A液。b. 其他：U型微量反應(yīng)板；微量加樣器 (25μL )；微量滴管 (C和D管)；移液管 (微量移液管和刻度滴管)；微量板振蕩器。,梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）,試驗前試劑應(yīng)恢復(fù)到15℃~30℃。a. B液加至微量反應(yīng)板孔內(nèi)，第1孔100μL， 第2孔25μL，第3、4孔各25μL；b. 取血清25μL加至第1孔，混勻后取25μL 至第2孔，混勻后取25μL至

19、第3孔，混勻后 取25μL至第4孔，混勻后棄去25μL。c. 第3孔加D液（未致敏顆粒）25μL， 第4孔加C液（致敏顆粒）25μL；d. 將反應(yīng)板置振蕩器振蕩30 s；e. 置有蓋濕盒，15～25℃避光孵育2h后， 觀察結(jié)果。,定量試驗,a. 加B液至微量反應(yīng)板孔，第1孔～第4孔與定性試驗相同，第5孔～第10孔各加25μL；b. 取血清25μL加至第1孔，如定性試驗稀釋方法，從第2孔～第10孔混勻，混勻后

20、第10孔棄去25μL；c. 第3孔加D液25μL，第4孔～第10孔各加C液25μL；d. 以后步驟同定性試驗。結(jié)果以最高血清稀釋度能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的稀釋度為抗體滴度結(jié)果顆粒光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊 陽性 4+顆粒光滑覆蓋大部分孔底 陽性 3+顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一顆粒環(huán) 陽性 2+顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯顆粒環(huán) 陽性 1+顆粒沉集孔底，中央形成一小點 可疑 ±顆粒緊密沉積孔底中央 陰性

21、-,報告方法,a. 陽性報告：定性試驗，血清在1:80以上稀釋度與致敏顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)（1+或更強(qiáng)），與未致敏顆粒（第3孔）不發(fā)生凝集反應(yīng)。定量試驗則應(yīng)報告發(fā)生陽性反應(yīng)的血清最高稀釋度，為血清滴度。b. 陰性報告：血清與致敏顆粒和未致敏顆粒均不發(fā)生凝集反應(yīng)。,注意事項,a. 微量反應(yīng)板要清潔干凈，孔內(nèi)無異物。b. 加入血清后，使用微量板振蕩器振蕩反應(yīng)板，而不可使用水平旋轉(zhuǎn)儀。c. 試劑盒不可置于0℃以下，防止凍結(jié)。不同批號試劑不可

22、混合使用。 d. 如未致敏顆粒出現(xiàn)凝集反應(yīng)，應(yīng)將血清進(jìn)行吸收處理后再進(jìn)行試驗，或用其他試驗方法。,梅毒血清反應(yīng)的假陽性反應(yīng),（1）梅毒血清反應(yīng)假陽性的分類 ①技術(shù)性假陽性反應(yīng) 由于標(biāo)本的保存不當(dāng)（如細(xì)胞污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或?qū)嶒炇也僮麇e誤所造成。 ②生物學(xué)假陽性反應(yīng) 是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗出現(xiàn)陽性（2）急性生物學(xué)假陽性反應(yīng) 很多非梅毒螺旋體感染性疾病，如風(fēng)疹、水痘、傳染性單核

23、細(xì)胞增多癥、病毒性肝炎、上呼吸道感染、肺炎球菌性肺炎、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、活動性肺結(jié)核、絲蟲病和溝端螺旋體病等。（3）慢性生物學(xué)假陽性反應(yīng) 可持續(xù)6個月以上或數(shù)年，甚至終生。,五、梅毒血清學(xué)試驗的結(jié)果解釋,六、梅毒實驗室操作要求,1． 實驗室要求清潔明亮，溫度保存在23～ 29℃。 2．儀器設(shè)備制定詳細(xì)的操作說明書，定期維護(hù)。 3．玻璃器皿或耗材要清潔干凈。 4．試驗操作要適合工作需要，操作人員要持證上崗。 5．操作規(guī)程要

24、確實可行，不得隨意改變。 6. 認(rèn)真精確操作標(biāo)本和試劑，包括各種移液器和所操作的 用具量的準(zhǔn)確。,,7．定期檢查說明書，操作保持與說明書的一致。8． 每次試驗設(shè)立陽性和陰性質(zhì)控，包括反應(yīng)性，介質(zhì)和每次試驗操作記錄是否一致性；9．標(biāo)本不應(yīng)溶血、乳糜狀，應(yīng)標(biāo)記血漿或血清，腦脊液是否有紅細(xì)胞；10．常規(guī)實驗室應(yīng)具有一定的空間，所有試驗的記錄，試驗鑒定，溫度記錄和原始數(shù)據(jù)應(yīng)保留；11．認(rèn)真監(jiān)督報告方式和記錄筆誤。,,12

25、. 梅毒血清學(xué)試驗操作和結(jié)果分析⑴標(biāo)本的采集和分離 ①編號或姓名登記 ②采血、分離血清和貯存⑵試劑準(zhǔn)備 ①溫度、器具的校正 ②試劑、血清和反應(yīng)板恢復(fù)到試驗溫度 ③試劑鑒定⑶試驗操作 ①血清量的控制 ②試劑量的控制 ③旋轉(zhuǎn)儀速度和時間的控制,,⑷ 實驗報告 ①核對編號或姓名 ②試驗結(jié)果分析 ③重復(fù)試驗(結(jié)果與

26、臨床表現(xiàn)不符) ④進(jìn)一步與臨床核對（病理討論） ⑤登記結(jié)果 ⑥發(fā)送報告,七、存在的問題,值得注意的是，臨床實驗室采用梅毒血清學(xué)方法檢測標(biāo)本時，由于方法學(xué)本身的局限性、患者的特殊情況、實驗條件和試劑或儀器的狀況等因素的影響，在結(jié)果判讀時，可能會出現(xiàn)假陰性或假陽性的情況。1．前帶現(xiàn)象：是指臨床上符合梅毒體征，但未經(jīng)稀釋血清的TRUST或RPR實驗呈陰性或弱陽性，若將血清稀釋后重復(fù)實驗，便可出現(xiàn)陽性結(jié)果。

27、原因是血清中抗心磷脂抗體過多，抑制了沉淀反應(yīng)的出現(xiàn)。為避免此類情況，不能只做原倍血清的檢測，可以同時作倍比稀釋血清的滴度檢測。2．病程的影響：初期或晚期梅毒患者血清TRUST或RPR可呈假陰性。原因是感染初期，非特異性心磷脂抗體遲于特異性抗體出現(xiàn)在血清中，而晚期梅毒非特異性抗體可消失。因此，RPR實驗不適合一期、三期和治療后梅毒的診斷,,3．溫度的變化：RPR是絮狀沉淀反應(yīng)，溫度可以改變絮狀物形成的速度，可能導(dǎo)致RPR假陰性。4、操

28、作不當(dāng)，可能導(dǎo)致實驗假陽性。5．特殊人群導(dǎo)致非梅毒螺旋體抗原試驗假陽性：多見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、風(fēng)濕熱和系統(tǒng)性硬化等自身免疫性疾病患者，也可見于水痘、麻風(fēng)和病毒性肝炎等病毒感染性疾病。此外，一些老人和炎癥患者亦會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，可能和他們特殊的生理免疫狀態(tài)有關(guān)。6．新生兒攜帶被動抗體導(dǎo)致RPR／TPPA檢測陽性：由于母體血梅毒螺旋體抗體IgG可經(jīng)胎盤傳給胎兒，使患兒血清呈被動陽性。因此，新生兒RPR或TPPA陽性時應(yīng)慎重診