梅毒實驗室檢測技術(shù)剖析

1、梅毒實驗室檢測技術(shù),,梅毒控制規(guī)劃中期評估-梅毒實驗室檢測知識調(diào)查（1）,1.一旦感染梅毒，梅毒螺旋體特異性抗體通常會終身陽性 2.RPR/TRUST只能用于梅毒初篩3. 二期梅毒時，TPPA和RPR兩種血清學試驗100％陽性4.接受抗梅治療的嬰兒，隨訪18個月后TPPA （+）/RPR（- ）可確診為胎傳梅毒 5.常規(guī)梅毒血清學檢測的是IgG抗體，不能檢測到IgM抗體6.TPPA（- ）/ RPR（+）結(jié)果一般可排

2、除梅毒螺旋體感染 7. TPPA滴度檢測是臨床治療梅毒效果評價的重要參考指標,2,梅毒控制規(guī)劃中期評估-梅毒實驗室檢測知識調(diào)查（2）,8. 新生兒血清TPPA（+）/ RPR（+），可診斷為先天梅毒9.梅毒初篩可采用任何一種血清學檢測方法10. RPR和TRUST的方法原理相同，所以兩種方法的定量試驗滴度結(jié)果一定一致11. TPPA（+）/ RPR（-）可能是極早期梅毒12. ELISA法檢測陽性，TPPA復(fù)檢陰性，最終結(jié)果

3、報告：TPPA試驗陰性，解釋ELISA法為假陽性。,3,實驗室檢測的目的？,早期發(fā)現(xiàn)臨床診斷有效治療精準醫(yī)療疫情報告,,檢測方法檢測策略,,結(jié)果的解讀和合理應(yīng)用醫(yī)生、檢驗、防保,,結(jié)果如何解讀和合理應(yīng)用,,,,,,,,,,,,,,,,,,如何發(fā)揮實驗室檢測作用,實驗室檢測 實驗室診斷艾滋病檢測策略最新進展（2015） 確證（診）試驗 → 補充試驗 陽、陰性→有、無反應(yīng) 增加了各種檢測

4、策略 強調(diào)臨床診斷,≠,梅毒是一個可以臨床治愈的傳染病,病例診斷依據(jù)病史癥狀實驗室檢查實驗室檢查結(jié)果對梅毒診斷及判愈有決定性意義,如和達到實驗室檢測的基本要求,檢測方法檢測策略質(zhì)量保證,,管理層面（行政、疾控）生產(chǎn)廠家醫(yī)療機構(gòu)（醫(yī)生、檢驗、防保）,常用梅毒實驗室檢測方法,檢測方法,病原學檢測梅毒螺旋體血清學試驗非梅毒螺旋體血清學組織病理學檢測白細胞檢測蛋白檢測,,未經(jīng)治療的梅毒病人的自然病程,,,

5、,感染梅毒螺旋體,一期梅毒,二期梅毒,隱形梅毒,三期梅毒,72%,30%,終生隱形梅毒,,,,,中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,,28%,感染梅毒螺旋體,2-6周,1-3月,1-3月,2-50年,,,,病原學檢查,原理：一期、二期梅毒時，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。方法：（1）暗視顯微鏡檢查

6、 （2）鍍銀染色法 （3）核酸檢測（血液標本？）注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功，僅能通過接種兔睪丸等部位進行有限增殖。,,病原學檢查的臨床意義,螺旋體檢查是診斷早期梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預(yù)后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。,梅毒血清學檢測方法,(1) 非梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （非特異性梅毒抗體）(2)

7、 梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （特異性梅毒抗體）兩類方法。問題： 為什么梅毒診斷需要上述兩類血清學檢測方法？,,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理,梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可對螺旋體表面的脂質(zhì)作出免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的非特異性抗體可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉(zhuǎn)為陰性。中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準 WS/T491—2016:梅毒非特異性抗體檢測操作

8、指南２０１６-０７-０７發(fā)布 ２０１６-１２-１５實施,非梅毒螺旋體抗原血清學原理,方法包括： （1）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗 (RPR) （2）甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST） （3）性病研究實驗室試驗 (VDRL)等?；境煞质切牧字?卵磷脂和膽固醇抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見上述方法的敏感性和特異性都基本相似,非梅毒螺旋

9、體抗原血清學試驗原理示意圖,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速？轉(zhuǎn)幅？,2、定性試驗加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布在整個圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下觀察結(jié)果,？滴/mL，1滴=？ul,√,×,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)幅,2、定性試驗

10、加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布在整個圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下觀察結(jié)果,60滴/mL，1滴=17ul,100r/min約18mm,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,3、定量試驗稀釋夜準備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi)加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列

11、稀釋，并涂布整個圈內(nèi)。 下同定性試驗。,,,,,,,,,,,,,？,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,問題：定量試驗原倍血清滴度是多少？,問題：定量試驗血清稀釋需要使用試管嗎？,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,3、定量試驗稀釋夜準備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi)加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內(nèi)。

12、下同定性試驗。,,,,,,,,,,,,,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,,非梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義,非梅毒螺旋體抗原血清試驗方法簡單、快速、敏感性和特異性較好?？勺鳛槊范竞Y查試驗。因治療后血清滴度可下降并陰性，故（1）可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征；（2）結(jié)梅毒螺旋體抗原血清學試驗鑒別梅毒現(xiàn)癥感染和既往感染VDRL試驗用于神經(jīng)梅毒腦脊液檢測特異性高，

13、檢測陽性可以作為神經(jīng)梅毒確診依據(jù)，但敏感性較低，即檢測陰性不能排除神經(jīng)梅毒。,,血清固定早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后 一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性 二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性。 晚期梅毒 治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽性。血清固定：一直保持低滴度，不轉(zhuǎn)陰,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗特點,,,,,,,,,,,,,1:1,1:2,1:8,1:4,1:16,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗特點,前帶現(xiàn)象,

14、,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗特點,假陽性反應(yīng)技術(shù)性假陽性反應(yīng)一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應(yīng)，經(jīng)過重復(fù)試驗即可排除。生物學假陽性反應(yīng)(一般滴度小于1:8），應(yīng)采用梅毒螺旋體抗原血清學試驗如TPPA等進行排除。,梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理,抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者終身陽性。問題：梅毒螺旋體抗原血清學試

15、驗的定量試驗在梅毒診療中有意義嗎？,梅毒螺旋體抗原血清學試驗方法,梅毒螺旋體顆粒凝集試驗 (TPPA) 梅毒螺旋體血球凝集試驗 (TPHA) 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 化學發(fā)光免疫分析法（CLIA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測 (RT) 熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）-IgM、IgG,TPPA,TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)

16、生可見的凝集反應(yīng)，具有較高的敏感性和特異性。 TPPA是目前WHO公認的梅毒抗原血清學試驗的“金標準”，常用于新方法、新試劑的參照標準。,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,明膠顆粒,梅毒抗原,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,抗原致敏顆粒,抗原致敏顆粒,血液中抗體,抗原抗體凝集,TPPA試驗原理示意圖,29,,4+：

17、 粒子光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊 3+： 粒子光滑覆蓋大部分底 2+：粒子光滑聚集覆蓋孔底，周圍有一細胞環(huán) 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周圍有一明顯細胞環(huán) ±： 粒子沉集孔底，中央形成一小點 –： 粒子緊密沉積孔底中央,TPPA試驗結(jié)果判讀,a:均為RPR陽性標本,ELI

18、SA/ CLIA,ELISA試驗是用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上梅毒血清和單克隆抗體酶標記物，形成抗原抗體復(fù)合物與酶標記物結(jié)合，用酶聯(lián)檢測儀判定試驗陽性反應(yīng)。本法可用于大樣本血清檢測?；瘜W發(fā)光法的臨床應(yīng)用意義基本同ELISA化學發(fā)光法的敏感性？？,梅毒免疫層析快速檢測方法（全血法）,31,梅毒免疫層析快速檢測方法（血清、血漿法）,梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義,作為非梅毒螺旋體抗原血清試驗(如RPR等)初篩陽性標本的確證試

19、驗，排除RPR 假陽性。不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗結(jié)果進行診斷。不能作為療效觀察的指標。,梅毒血清學試驗結(jié)果解釋（梅毒臨床診斷參考依據(jù)）,34,問題：此結(jié)果解釋適用于先天（胎傳）梅毒嗎？,梅毒IgM抗體（TP-IgM）,IgM抗體的產(chǎn)生是感染后的早期體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。IgM分子比IgG較大，所以IgM抗體不能通過胎盤屏障。而母親的IgG抗體可以通過胎盤屏障傳給胎兒。因此若在新生兒血中檢測到IgG抗體不

20、能作為先天梅毒的診斷依據(jù)，而IgM抗體可為先天梅毒的診斷依據(jù)。 IgM抗體檢測其特異性較高，但敏感性較低。因此，IgM抗體檢測陰性，不能排除先天梅毒感染。,35,先天梅毒的診斷,先天梅毒的診斷標準梅毒暴露嬰兒具有以下條件之一：暗視野顯微鏡檢梅毒螺旋體陽性梅毒螺旋體IgM抗體陽性*RPR/TRUST檢測陽性，滴度比母親分娩前最近一次滴度高4倍及以上RPR/TRUST檢測隨訪中，任何一次滴度不下降或反而上升

21、滿18月齡后，TPPA檢測陽性,36,37,,梅毒實驗室檢測策略,,梅毒實驗室檢測策略思考,,,39,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗,梅毒螺旋體抗原血清學試驗,,排除試驗假陽性確證梅毒螺旋體現(xiàn)癥感染,,排除治愈的既往感染者確證梅毒螺旋體現(xiàn)癥感染,？RPR：初篩試驗 TPPA：確證試驗,40,,,,41,陽性,42,,,43,陽性,梅毒篩查最佳策略,,,2015非梅毒螺旋體血清學試劑評估,45,46,2015梅毒螺旋體抗原血清學試

22、劑評估,實驗室生物安全防護要求,一級生物安全防護水平：適用于第四類病原微生物二級生物安全防護水平：適用于第三類病原微生物三級生物安全防護水平：適用于第二類病原微生物四級生物安全防護水平：適用于第一類病原微生物,47,一般臨床血標本處理是否需要在幾級生物安全實驗室操作?,梅毒實驗室安全生物暴露,a) 不慎發(fā)生標本污染工作臺，不要立即用水沖洗，應(yīng)先用紙巾、布等敷料加上消毒液（如10%次氯酸鈉，75%乙醇等）消毒30分鐘以上，然后再清洗

23、。如污染工作服，應(yīng)立即脫下，高壓滅菌。b) 實驗時手部污染，應(yīng)立即用肥皂洗手并沖洗干凈，再外用消毒藥水，如誤入口內(nèi)，應(yīng)立即吐出，并用清水反復(fù)漱口，必要時根據(jù)實際情況用藥。c）被刺傷、劃傷等，應(yīng)先擠壓后沖洗，再擦以碘酒等簡單處理后，立即到醫(yī)院接受青霉素治療，同時應(yīng)做梅毒血清學檢測（？？）d) 出現(xiàn)與所檢測對象引起的疾病相似癥狀時，立即就醫(yī)。,48,梅毒控制規(guī)劃中期評估-梅毒實驗室檢測知識調(diào)查（1）,1.一旦感染梅毒，梅毒螺旋體特異

24、性抗體通常會終身陽性 2.RPR/TRUST只能用于梅毒初篩3. 二期梅毒時，TPPA和RPR兩種血清學試驗100％陽性4.接受抗梅治療的嬰兒，隨訪18個月后TPPA （+）/RPR（- ）可確診為胎傳梅毒 5.常規(guī)梅毒血清學檢測的是IgG抗體，不能檢測到IgM抗體6.TPPA（- ）/ RPR（+）結(jié)果一般可排除梅毒螺旋體感染 7. TPPA滴度檢測是臨床治療梅毒效果評價的重要參考指標,49,梅毒控制規(guī)劃中期評估-