torch檢測方法 ppt課件

1、TORCH感染檢測方法與結果分析,,1971 年Nahmias 等首先描述了病原體感染對胎兒的致畸作用，他將數(shù)種能引起孕期宮內感染，甚至造成先天缺陷或發(fā)育異常的病原體英文名詞的第一個字母組合而成“TORCH”，即弓形蟲 ( TOX) 、風疹病毒(RV) 、巨細胞病毒(CMV) 、單純皰疹病毒(HSV)、其他(OTH)。其他病原體感染包括細小病毒（B19）、沙眼衣原體（CT）、解脲支原體（UU）等。近幾年人乳頭瘤病毒（HPV）、淋球菌（

2、GC）感染率明顯上升，也引起學者重視。,孕期TORCH感染通常無癥狀，但對胎兒可造成危害，可導致自然流產(chǎn)、胎兒畸形、死胎、胎兒生長受限（FGR）、早產(chǎn)及新生兒疾病等嚴重并發(fā)癥。雖然TORCH感染對胎兒、新生兒能夠產(chǎn)生不利影響，但經(jīng)積極治療后再次受孕仍可分娩正常嬰兒。因此在孕前監(jiān)測TORCH 感染，爭取在孕前進行干預，選擇適宜的妊娠時機受孕，可減少不良妊娠結局的發(fā)生，對減少先天性感染兒及病殘兒的出生極為重要。,TORCH

3、感染臨床檢測最常用的方法包括兩種： TORCH抗體的檢測 TORCH病原體的檢測,一、TORCH抗體檢測方法與結果分析 1、檢測方法 用于測定液體標本中的微量物質，最常用的是免疫標記技術，是指用熒光素、酶、放射性同位素、發(fā)光劑或電子致密物質標記抗體或抗原后進行的抗原抗體的反應。這類檢測技術的優(yōu)點是特異、靈敏、快速、能夠定性和定量、易于觀察結果等。我們實驗室檢測TORCH抗體采用的方法是酶免疫測定

4、中的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），它是用酶標記抗體或酶標記抗抗體進行的抗原抗體反應。,（1）標本采集和處理 病人無需空腹，通過無菌性靜脈穿刺采集自凝血樣本2ml，離心后留取血清，最好是新鮮血清用于測定，如不能立即測定可保存于-20℃，不能反復凍融。溶血、高脂血癥、黃疸可能影響檢測結果。,,（2）檢測原理 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是根據(jù)酶免疫測定原理發(fā)展的一種固相免疫酶技術，目前廣泛應用于各種抗原和抗體的檢測。ELISA的

5、基本原理是：①抗原和抗體能與固相載體表面結合并保持其免疫活性；②抗原和抗體與酶結合成的標記物，既能保持抗原或抗體的免疫活性，又能保持酶的活性；③受檢物中的抗原或抗體與固相表面的抗體或抗原發(fā)生免疫反應并結合在固相表面，此抗原抗體復合物又能結合相應的酶標記物 ,,用洗滌方法除去未結合而游離的酶標記物，繼而加入酶反應的底物后，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，顯色的程度與受檢物中的抗原或抗體的量直接相關，用合適的分光光度計或酶標儀進行比色，根據(jù)顏色反應

6、的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，一般1分子酶在1min內可催化數(shù)十萬乃至上千萬分子底物變?yōu)楫a(chǎn)物，故可極大地放大反應結果，從而使測定方法具有很高的敏感度。,我們實驗室檢測抗體的具體步驟是:先將已知的可溶性抗原吸附于某一種固相載體表面，并保持其免疫活性。加入待檢血清，患者血清與固相載體表面的抗原接觸起反應，如血清中有相應特異性抗體存在，則抗體會與抗原結合在固相載體上，形成抗原—抗體復合物，洗滌去除過多的抗體。然后加入用辣根過

7、氧化物酶標記的抗體復合物，后者將會與抗原—抗體復合物結合。,通過洗滌，洗去未反應的酶標記抗體，這樣結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）后，底物經(jīng)酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，用酶標儀進行比色，根據(jù)顏色反應的深淺進行定性分析。,,,2、結果分析 抗體中的IgM和IgG以高濃度遍布全身，是全身性體液免疫反應的主要效應分子。IgM是初次體液免疫應答早期

8、階段產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，主要分布于血液中，抗全身感染的作用較強。IgG是再次體液免疫應答產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，在血漿和組織液中各占50%左右，故幾乎分布于全身各組織及體液中。IgG是唯一能通過胎盤的免疫球蛋白，故對新生兒抗感染起重要作用。,TORCH感染后，一般首先出現(xiàn)的是IgM，然后才產(chǎn)生IgG，感染后5～6天IgM＞IgG，20～30天IgM達到高峰。感染后4～8周IgG達到高峰，并維持多年至終生。,抗體實驗結果解釋參考表：,,,

9、,,,IgM IgG 結 果 解 釋,－ － 從未感染過。易感人群,＋ － 兩周后復查，結果相同， 考慮為近期感染,－ ＋ 遠期感染過，近期無感染,＋ ＋ 原發(fā)性感染或再感染,,,,,,,孕婦血清中IgM 陽性是診斷活動性感染重要而可靠的指標，但由于它實際檢測

10、的是人體對TORCH感染的免疫反應狀態(tài)，因此對那些處于潛伏狀態(tài)不排毒的孕婦，或免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的孕婦，易出現(xiàn)漏檢。 隨著分子生物學技術的發(fā)展，根據(jù)檢測病原體DNA 或RNA 的水平對感染進行診斷就更為直接，并越來越受到圍產(chǎn)醫(yī)學界的關注。 TORCH抗體的檢測一般用于孕前和孕早期病原體感染的篩查，IgM陽性婦女需進一步作病原體DNA或RNA檢測以明確感染的存在。,二、TORCH病原體的檢測方法與結果分析

11、 1、檢測方法 檢測TORCH病原體，臨床常用方法是聚合酶鏈反應（PCR），又稱體外酶促基因擴增法。 （1）標本采集 TOX采集EDTA防凝血2ml，利用低滲法提取白細胞；RV、CMV采取自凝血，離心提取血清；HSV、CT、UU、NG、HPV等采取宮頸分泌物。,,（2）技術原理 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合

12、酶的酶促合成反應。PCR由高溫變性—低溫退火—中溫延伸三個基本反應步驟構成：① 模板DNA的變性：通過加熱使模板DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離成單鏈，以便它與引物結合；② 模板DNA與引物的退火（復性）：引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。,當溫度突然降低時由于模板DNA的分子結構較引物要復雜的多，而且反應體系中引物DNA的量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA之間互補的機會較少。③ 引物的延伸：

13、在DNA聚合酶和四種脫氧核糖三磷酸底物及Mg2存在的條件下，模板-引物結合物，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。以上三步為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板。這樣反復循環(huán)以上反應過程就能將待測目的基因數(shù)量呈指數(shù)倍數(shù)擴增放大幾百萬倍。,PCR產(chǎn)物可用凝膠電泳分析法分析結果。常用的是瓊脂糖凝膠電泳，在配制瓊脂糖時加入0.5μg/ml的溴化乙錠（EB），或在電泳后凝膠用電泳緩沖液配制的同樣濃度的EB液染色15-30mi

14、n，紫外燈下觀察結果并拍照記錄。,,,,,我們實驗室采用的是實時熒光定量PCR方法，常規(guī)PCR存在著不能定量和產(chǎn)物污染假陽性等問題，使其臨床應用受到限制。實時熒光定量PCR就是利用熒光信號檢測整個PCR擴增過程，獲得在線描述PCR過程動力學曲線。其原理是在常規(guī)PCR擴增體系中，加入一個與靶基因序列特異互補的雙熒光標記探針。探針的5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團。當探針完整時，由于淬滅基團的淬滅作用，熒光報告基團不能產(chǎn)生熒光

15、發(fā)射。,當有靶基因存在時，在PCR的復性延伸期，標記探針即與靶基因互補結合，新合成鏈從引物開始，沿膜板延伸，當新鏈延伸至標記探針結合部時，DNA聚合酶具有5’—3’的外切酶活性，將探針5’端熒光報告基團切下。從而，熒光報告基團淬滅作用被解除，產(chǎn)生熒光發(fā)射。通過熒光光譜分析儀連續(xù)不斷地檢測反應體系中的熒光信號的變化。,其定量原理是：首先根據(jù)PCR擴增過程中，產(chǎn)物信號（熒光）尚未出現(xiàn)前本底熒光信號平均值加3個標準差確定為熒光閾值。在PCR反

16、應中設置原始已知定量膜板管進行擴增，這樣不同定量膜板管經(jīng)過不同循環(huán)次數(shù)達到熒光閾值，此時的循環(huán)次數(shù)(Ct值：也稱循環(huán)閾值) 就被記錄下來。該循環(huán)參數(shù)和PCR 體系中起始DNA量的對數(shù)值之間有嚴格的線性關系，根據(jù)循環(huán)參數(shù)Ct 值就可以準確計算出起始DNA的數(shù)量。即能得出待測樣品原始膜板的數(shù)量，從而實現(xiàn)樣品膜板的定量。,熒光定量基因擴增技術的優(yōu)點是特異性強，克服了假陽性的主要來源，可準確定量出低至1個拷貝/微升的病原體，真實地反映了病人體內