艾滋病梅毒和乙肝檢測方法介紹及選擇ppt課件

1、艾滋病、梅毒、乙肝檢測方法介紹及選擇艾滋病、梅毒、乙肝概況母嬰傳播艾滋?。杭s15～35%HIV陽性孕婦會(huì)發(fā)生母嬰傳播。90%以上兒童HIV感染者是由母親垂直傳播而感染。梅毒：流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或馬鞍鼻、先天性耳聾等。乙肝：在我國，人群中4050%是由母嬰傳播積累而成。主要內(nèi)容一.艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)HIV抗體檢測核酸檢測CD4T淋巴細(xì)胞檢測二.梅毒檢測技術(shù)顯微鏡檢查法血清學(xué)檢查法三.乙肝檢測技術(shù)HBV免疫標(biāo)志物檢測HBVDNA一、艾滋病檢

2、測技術(shù)HIV抗體檢測核酸檢測CD4T淋巴細(xì)胞檢測HIV抗體檢測篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù)檢）確證試驗(yàn)（WB）HIV抗體篩查樣品血清血漿全血濾紙干血斑唾液尿液篩查試劑國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)有效期內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格選擇敏感性和特異性高的試劑篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)：采用發(fā)光或熒光底物，用發(fā)光或熒光儀測定結(jié)果?？焖贆z測（RT）及其它檢測試驗(yàn)(1)明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)(2)免疫滲濾試驗(yàn)(3)免

3、疫層析試驗(yàn)(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）HIV抗體檢測試劑：檢測HIV12抗體HIV抗原抗體聯(lián)合檢測試劑：可同時(shí)檢測血液中HIV1P24抗原和HIV12抗體用酶標(biāo)儀測定結(jié)果四代艾滋病酶聯(lián)免疫試劑比較第四代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV12Oantip24AbIgMIgG抗體HIV12Op24抗原病毒裂解液重組抗原合成肽HIV12Oantip24抗體ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISAEnzymelinkedimmunosbenta

4、ssayveve陰性對(duì)照陽性對(duì)照陰性陽性質(zhì)控酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)客觀、結(jié)果便于記錄和保存用途：流行病學(xué)監(jiān)測及臨床大量標(biāo)本的檢測(2)化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)采用發(fā)光或熒光底物既可檢測抗體，也可聯(lián)合檢測抗原抗體酶或熒光標(biāo)記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物用發(fā)光儀或熒光儀測定結(jié)果全血樣品加50ul樣品于樣品墊中手指血方法靜脈血方法加一滴緩沖液15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果（3）快速檢測（RT）及其它檢測

5、試驗(yàn)快速檢測（RT）及其它檢測試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn):試驗(yàn)簡便快速，適用于應(yīng)急檢測、門診急診檢測。不需專門設(shè)備和人員培訓(xùn)一般可在10～30分鐘內(nèi)得出結(jié)果。缺點(diǎn):肉眼判斷較主觀、價(jià)格較貴、結(jié)果不易保存。HIV抗體篩查檢測流程圖HIV抗體確證試驗(yàn)確證試驗(yàn)的試劑：必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。確證樣品：可采用血清、血漿、濾紙干血斑確證試驗(yàn)方法：免疫印跡試驗(yàn)(WB)、條帶免疫試驗(yàn)(LIATEKHIVⅢ)、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA

6、)及免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。國內(nèi)常用的確證試驗(yàn)方法是WB。HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果初篩檢測陽性標(biāo)本兩種篩查試劑報(bào)告陰性陰性反應(yīng)一陰一陽陽性反應(yīng)確證試劑復(fù)檢試驗(yàn)根據(jù)具體情況進(jìn)一步檢測HIV2報(bào)告陰性出現(xiàn)HIV2指示條帶陰性反應(yīng)不確定反應(yīng)報(bào)告HIV1陽性HIV1陽性反應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)資料，可以在4周后隨訪檢測，如帶型沒有進(jìn)展或呈陰性反應(yīng)，則報(bào)告陰性；如隨訪期間出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則報(bào)告陽性；如隨訪期間帶型有進(jìn)展，但不滿足陽性標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)繼續(xù)隨訪到8周。如

7、帶型沒有進(jìn)展或呈陰性反應(yīng)則報(bào)告陰性；滿足HIV抗體陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)則報(bào)告陽性，不滿足陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)可視情況決定是否繼續(xù)隨訪。HIV抗體確證檢測流程圖產(chǎn)時(shí)艾滋病抗體檢測及服務(wù)流程實(shí)驗(yàn)室需備有：1～2種HIV12抗體ELISA（化學(xué)發(fā)光）試劑2種HIV12抗體快速試劑百度“HIV抗體試劑臨床評(píng)估”HIV抗體母親HIV抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒，出生時(shí)新生兒和嬰兒早期抗體陽性，不一定是感染出生時(shí)母親的抗體，80~90%在生后9~12個(gè)月消失，出生后18個(gè)月

8、基本上全部消失18個(gè)月后兒童HIV抗體仍然陽性，視為自身感染產(chǎn)生的抗體18個(gè)月以下嬰幼兒的HIV診斷嬰幼兒HIV感染的抗體檢測適用于：HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒；母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染的兒童。嬰兒12個(gè)月時(shí)進(jìn)行HIV抗體檢測陰性排除感染，納入正常兒童保??；陽性者繼續(xù)追蹤隨訪，至18個(gè)月再次進(jìn)行HIV抗體檢測，結(jié)果陰性排除感染。艾滋病病毒感染產(chǎn)婦所生兒童陽陰用另一種不同原理或不同廠家生產(chǎn)的篩查

9、試劑再次檢測12個(gè)月進(jìn)行HIV抗體篩查試驗(yàn)確證試驗(yàn)18個(gè)月時(shí)再進(jìn)行HIV抗體篩查試驗(yàn)報(bào)告HIV抗體檢測結(jié)果陰性艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV抗體檢測流程陽性陰性陰性陽性用另一種不同原理或不同廠家生產(chǎn)的篩查試劑再次檢測陰性陰性陽性報(bào)告HIV抗體檢測結(jié)果陽性提供咨詢，繼續(xù)隨訪，4周后再次進(jìn)行確證試驗(yàn)不確定陽性18個(gè)月以下嬰幼兒的HIV診斷核酸檢測HIV前病毒DNA（HIVDNA）檢測已整合到外周血液中血細(xì)胞基因組上的HIVDNA基于PCR技術(shù)

10、高特異度(98%)和高靈敏度(99%)18個(gè)月以下嬰幼兒的HIV診斷HIV病毒載量（HIVRNA）用來監(jiān)測已知的HIV感染病人的病毒載量試驗(yàn)；真陽性的結(jié)果通常100000拷貝毫升而假陽性結(jié)果1000拷貝毫升RTPCR、NASBA、CDNA、熒光定量PCR嬰幼兒HIV感染的核酸檢測可檢測HIVRNA也可檢測HIVDNA首選檢測HIVDNAHIVDNA檢測不受母親圍產(chǎn)期抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和人乳汁中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物以及嬰幼兒預(yù)防性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治

11、療的干擾考慮母親血液污染因素，不推薦使用臍帶血進(jìn)行HIV核酸檢測。嬰兒的早期診斷HIV感染母親所生小于18個(gè)月齡的嬰兒，不同時(shí)間的兩次HIV核酸檢測均為陽性即可作出診斷。18個(gè)月齡以上兒童診斷與成人相同：有急性HIV感染綜合癥或流行病學(xué)史，且不同時(shí)間的兩次HIV核酸檢測結(jié)果均為陽性，即可診斷。HIV感染產(chǎn)婦所生嬰兒嬰兒滿3個(gè)月，再次采集血標(biāo)本，送檢盡快采集第二份血標(biāo)本，送檢出生后6周采集第一份血標(biāo)本（可制備成濾紙片干血斑（DBS），或E

12、DTA抗凝全血），送檢繼續(xù)隨訪報(bào)告陽性艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV感染早期診斷檢測流程呈陰性反應(yīng)呈陽性反應(yīng)呈陽性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)呈陽性反應(yīng)盡快再次采集血樣，送檢報(bào)告陰性呈陽性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)嬰幼兒HIV感染的核酸檢測需要注意：不同時(shí)間“嬰兒HIV感染早期診斷”檢測均呈陰性反應(yīng)的喂哺母乳的兒童，應(yīng)在完全停止喂哺母乳后的6周和3個(gè)月（若6周時(shí)檢測結(jié)果為陽性可盡快）再次采血進(jìn)行核酸定性檢測。兒童滿18個(gè)月后則可直接進(jìn)行抗體檢測。嬰幼兒H

13、IV感染的核酸檢測方法HIVDNA1）RocheAmplicHIV1DNAPCRversion1.5試劑盒2）INHOUSE（國內(nèi)開展，2009年檢測技術(shù)規(guī)范）AmplicHIV1DNA簡介樣本：濾紙片干血斑、EDTA抗凝全血方法學(xué)：PCRELISA結(jié)果類型：定性靶物質(zhì)：感染宿主細(xì)胞中的proviralHIV1DNA濾紙片干血斑將全血滴在特定的濾紙片上制備。它主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中新生兒先天性缺陷疾病的早期篩查。如：苯丙酮尿癥，先天性甲狀

14、腺機(jī)能低下，維生素缺乏和一些感染性疾病的檢測。濾紙片干血斑用于嬰兒HIV診斷樣本量非常小，(20?lto200?l)特別適宜采集嬰兒樣本。容易收集:指尖血、后跟血。能提取全血，血漿、血清。短期運(yùn)輸可在常溫下長期可貯存在–20C樣本可在常溫下運(yùn)輸:不需要干冰DBS可作為一種無感染性材料運(yùn)輸（在美國）濾紙片的選擇Whatman903濾紙片（可用于HIV抗體、HIV前病毒DNA和HIVRNA檢測）FTA標(biāo)準(zhǔn)卡濾紙片（可用于HIV前病毒DNA檢

15、測）采集樣本所需要的材料血樣本采集卡片(濾紙片)；可密封的塑料袋；濕度指示卡；干燥劑（12g袋）；怎樣采集末梢血DBS應(yīng)用通用的安全防護(hù)措施；清晰準(zhǔn)確地在卡片上標(biāo)記識(shí)別碼；完成針刺指尖程序；均一地使每個(gè)印圈飽和地吸附血液；兩個(gè)充分吸附血液的印圈比五個(gè)不完全吸附的印圈要好怎樣采集抗凝靜脈血DBS靜脈血充分與EDTA混合；最好采集后立即制備干血斑；血漿與血細(xì)胞分層的全血在制備干血斑前，應(yīng)輕柔地上下顛倒采血管（避免血細(xì)胞破裂），使血液混勻后制

16、備；用移液槍加代濾芯槍頭移取7580ul血液；槍頭對(duì)準(zhǔn)印圈的中心緩慢將血液滴于濾紙上；避免有氣泡；怎樣干燥DBS避免觸摸或涂抹血斑；室溫空氣中水平干燥（至少4個(gè)小時(shí)）；避免陽光直曬；在干燥過程中不允許加熱，疊加或?qū)BS接觸其他表面；在包裝前充分干燥DBS濾紙片干血斑的包裝與運(yùn)輸將完全干燥的濾紙片干血斑樣本用塑料袋進(jìn)行獨(dú)立包裝，或者用秤量紙隔開，以避免樣本之間的污染。已獨(dú)立包裝好的樣本一起放入密封塑料袋中，加入幾包干燥劑加入濕度指示卡。

17、將包裝好的濾紙片干血斑，連同相應(yīng)的文件（如采樣送樣單等）放入大信封中。密封后可郵寄運(yùn)輸。放入密封袋加入干燥劑加入濕度指示卡標(biāo)記袋中內(nèi)容物核酸檢測2次檢測陽性可早期診斷HIV感染，如果不具備條件，也可用HIV病毒載量法來代替，2次檢測陽性也可診斷HIV感染，18個(gè)月齡以后再做抗體檢測確認(rèn)。HIV核酸定量檢測通過SFDA審批的試劑盒、方法NASBAEasyQAmplicTaqmanbDNA340440M2000PGCD4T淋巴細(xì)胞檢測CD4

18、T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)廣泛應(yīng)用于HIV感染者的臨床管理中，協(xié)助判斷感染者的預(yù)后、指導(dǎo)實(shí)施抗病毒治療和療效觀察以及藥物預(yù)防機(jī)會(huì)性感染等方面。CD4T淋巴細(xì)胞檢測對(duì)于免疫功能相對(duì)較好，CD4T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)350mm3的艾滋病感染孕產(chǎn)婦，采用預(yù)防性抗病毒用藥方案；對(duì)于CD4T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≤350mm3的艾滋病感染孕產(chǎn)婦，采用治療性抗病毒用藥方案。常規(guī)CD4T淋巴細(xì)胞檢測的方法和程序流式細(xì)胞儀檢測方法雙平臺(tái)方法單平臺(tái)方法樣品：EDTA、枸櫞酸（ACD）

19、或肝素抗凝全血運(yùn)送條件：室溫（18～25℃）保存和運(yùn)輸樣品避免極端溫度（結(jié)冰或大于37℃）高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中。常規(guī)CD4T淋巴細(xì)胞檢測的方法和程序48小時(shí)內(nèi)染色，染色后6小時(shí)內(nèi)分析；如采血后24小時(shí)內(nèi)染色，可在染色后24小時(shí)內(nèi)分析；利用CD45單克隆抗體設(shè)淋巴細(xì)胞門，可檢測放置72小時(shí)的樣品；在血球分析儀生產(chǎn)商允許的樣品采集時(shí)間范圍內(nèi)檢測。FACSCalibur流式細(xì)胞儀二、梅毒檢測技術(shù)顯

20、微鏡檢查法血清學(xué)檢查法梅毒特異性抗原血清學(xué)檢測梅毒非特異性抗原血清學(xué)檢測各期梅毒的取材部位和檢查方法臨床表現(xiàn)取材部位檢查方法一期梅毒潰瘍、淋巴結(jié)暗視野檢查血液血清學(xué)檢查二期梅毒皮損、淋巴結(jié)暗視野檢查血液血清學(xué)檢查三期梅毒血液、腦脊液血清學(xué)檢查隱性梅毒血液血清學(xué)檢查胎傳梅毒皮損、胎盤暗視野檢查血液血清學(xué)檢查（一)、顯微鏡檢查法1.暗視野顯微鏡檢查2.直接免疫熒光試驗(yàn)（DFA）3.渡銀染色檢查1.暗視野顯微鏡檢查暗視野顯微鏡下，典型的梅毒螺

21、旋體呈白色發(fā)光其螺旋較密而均勻。運(yùn)動(dòng)規(guī)律，運(yùn)動(dòng)性較強(qiáng)，其運(yùn)動(dòng)方式包括①旋轉(zhuǎn)式，圍繞其長軸旋轉(zhuǎn)；②蛇行式全身彎曲如蛇行；③伸縮其螺旋間距離而移動(dòng)。觀察其運(yùn)動(dòng)形式有助于與其他螺旋體相鑒別。未檢出螺旋體不能排除梅毒的診斷，陰性結(jié)果可能說明：①螺旋體數(shù)量不足(單次暗視野顯微鏡檢查陽性率小于50%)。②患者已接受抗生素或殺滅梅毒螺旋體的藥物治療。③損害接近自然消退。④損害不是梅毒。2.直接免疫熒光試驗(yàn)（DFA)在熒光顯微鏡下可見到發(fā)蘋果綠色的梅毒

22、螺旋體。臨床意義與暗視野顯微鏡檢測相同。DFA的特異性及敏感性均大于暗視野顯微鏡檢測。3.梅毒螺旋體渡銀染色檢查梅毒螺旋體具有親銀性，顯微鏡下可見到染成棕色的梅毒螺旋體。臨床意義基本同暗視野顯微鏡檢查法。(二)、血清學(xué)檢查法血清學(xué)檢查是輔助診斷梅毒的重要手段。當(dāng)人體感染梅毒螺旋體后4～10周左右，血清中可產(chǎn)生一定數(shù)量的抗類脂質(zhì)抗原的非特異性反應(yīng)素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋體抗原的特異性抗體（主要是IgM、IgG）。這些抗體均可

23、用免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測。梅毒血清學(xué)檢測方法1.非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)1.1性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VenerealDiseaseResearchLabatytest，VDRL）1.2快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（Rapidplasmareagincirclecardtest，RPR）1.3甲苯胺紅試驗(yàn)（Toluidineredunheatedserumtest，TRUST）方法簡便、快速，敏感性和特異性較好。對(duì)一期梅毒的敏感性為74％～87％

24、，二期梅毒達(dá)100％，三期梅毒34％～94％。特異性96％～99％。非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)臨床意義適用于各期梅毒的診斷。早期梅毒經(jīng)治療后血清滴度可下降或轉(zhuǎn)陰，故可用于療效觀察、判愈、判定復(fù)發(fā)或再感染。也適用于人群的篩查、產(chǎn)前檢查及健康體檢等。VDRL試驗(yàn)適用于神經(jīng)梅毒的腦脊液檢查特異性高，但敏感性低?？稍谀承﹤魅静〖澳z原病時(shí)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此對(duì)陽性反應(yīng)應(yīng)結(jié)合臨床進(jìn)行鑒別，或做梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)以進(jìn)一步證實(shí)之。2.梅毒螺旋體抗原血

25、清試驗(yàn)采用梅毒螺旋體作抗原，為特異性抗原，檢測血清中抗梅毒螺旋體IgG或IgM抗體。敏感性和特異性均較高。一期梅毒的敏感性為70％～100％，二期梅毒達(dá)100％，三期梅毒95％～98％，特異性94％～100％。梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）原理TPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)。明膠顆粒為玫瑰紅色，便于肉眼觀察結(jié)果。梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TPELISA）原理

26、用經(jīng)純化及超聲裂解處理的梅毒螺旋體為抗原包被固相板條加入待檢血清和辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，利用酶免疫法檢測患者血清中的抗梅毒螺旋體特異性抗體。采用特異的梅毒螺旋體重組蛋白作為抗原，使試驗(yàn)更加敏感、特異。梅毒IgM抗體血清學(xué)試驗(yàn)梅毒特異性IgM抗體是梅毒感染最早期產(chǎn)生的抗體。IgM分子量較大不能通過胎盤屏障。因此在新生兒血中檢測到IgM抗體表明有先天感染。如在患者的腦脊液檢測到IgM抗體表明有活動(dòng)性神經(jīng)梅毒。血液中或腦脊液中出現(xiàn)

27、抗梅毒IgM抗體均表示需要治療。梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)臨床意義梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)多用作證實(shí)試驗(yàn)，特別是隱性梅毒及一些非螺旋體抗原血清試驗(yàn)陰性而又懷疑為梅毒的患者。但不能用于觀察療效、判斷復(fù)發(fā)及再感染。梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)偶可出現(xiàn)生物學(xué)假陽性反應(yīng)。梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的合理應(yīng)用非梅毒螺旋體試驗(yàn)陽性可能表示：現(xiàn)癥感染、接受或未接受過治療的近期感染、生物學(xué)假陽性結(jié)果。在一般人群中的假陽性率是13%。大部分假陽性血清抗體滴度1:4，但低滴度不能

28、排除梅毒，可出現(xiàn)在潛伏或晚期梅毒病人中。梅毒螺旋體試驗(yàn)陽性可表示：現(xiàn)癥感染、接受或未接受過治療的近期感染、既往感染。梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果解釋梅毒感染產(chǎn)婦所生兒童隨訪及先天梅毒感染狀態(tài)監(jiān)測圖承擔(dān)母嬰阻斷梅毒檢測工作的實(shí)驗(yàn)室需備有非梅毒螺旋體抗原血清試劑（TRUST或RPR）梅毒螺旋體抗原血清試劑（TPPA或TPELISA、TPRT）有條件可備TPIgM診斷、監(jiān)測方法HBV血清學(xué)試驗(yàn)EIA檢測HBsAg、ImmunoblotassayHBV

29、DNA定性試驗(yàn)PCRHBVDNA定量試驗(yàn)PCR、bDNAALT肝活檢基因分型三.乙肝檢測技術(shù)診斷乙肝感染者和現(xiàn)患病人的最佳實(shí)驗(yàn)室方法HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(ELISA)可重復(fù)，經(jīng)濟(jì)，經(jīng)FDA認(rèn)可HBsAg抗HBsHBeAg抗HBe抗HBc化學(xué)發(fā)光法RTHBsAg在感染HBV兩周后即可陽性，HBsAg陽性反映現(xiàn)癥HBV感染。HBVDNA定量檢測是病毒復(fù)制水平最可靠與直接的證據(jù)，與傳染性和疾病進(jìn)展密切相關(guān)。謝謝！email:33466145