鼠解剖采樣及血清、培養(yǎng)分離檢驗(yàn)

1、鼠解剖采樣及血清、培養(yǎng)分離檢驗(yàn)技術(shù),溫州市疾病預(yù)防控制中心,一、鼠疫菌概況1.鼠疫菌的發(fā)現(xiàn)：,1894年香港鼠疫大流行時(shí)，日本學(xué)者北里和法國(guó)學(xué)者耶爾森同時(shí)從尸體的淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)了這種致病菌，同年9月被命名為鼠疫桿菌。,2.鼠疫菌的地位：,鼠疫菌在分類學(xué)上屬真細(xì)菌目、腸桿菌科、耶爾森氏菌屬（Genus yersinia）。本屬中的細(xì)菌除鼠疫桿菌(Yersinia pestis)外，還有假結(jié)核桿菌（Yersinia Pseudotuterc

2、ulosis）和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）。,鼠疫桿菌的生物學(xué)特性,1.形態(tài)和染色典型的鼠疫桿菌短而粗、兩極濃染、兩端鈍園、中間澎大， 幾乎成卵園或橢園形，菌體長(zhǎng)約1.5～1.8微米，寬0.5～0.7微米。有莢膜、無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞。革蘭氏染色陰性。但鼠疫菌形態(tài)表現(xiàn)上具有明顯的多形性變化，即形態(tài)很不一致，如卵球型或長(zhǎng)短不一的長(zhǎng)桿形菌細(xì)胞等。,用病人材料，死于鼠疫的人尸和動(dòng)物尸體的新鮮臟器制備的

3、涂片，可見(jiàn)到兩端鈍園，兩極濃染的典型鼠疫桿菌，呈散在或小堆，偶見(jiàn)鏈狀排列。在陳舊性病灶及腐敗材料中，常見(jiàn)到菌體澎大和著色不良的球形菌影及其他變形的鼠疫桿菌。在壓印標(biāo)本中，可以看到吞噬細(xì)胞內(nèi)外有鼠疫桿菌。此點(diǎn)對(duì)于鑒別雜菌污染材料有很大的價(jià)值，因?yàn)閯?dòng)物死后，污染的雜菌不會(huì)被吞噬細(xì)胞所吞噬。,培養(yǎng)特性,鼠疫桿菌為需氣，亦為兼性厭氣性的細(xì)菌，故非絕對(duì)需氣性菌。在氧氣充足時(shí)，固然發(fā)育較好。 鼠疫桿菌能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育。 培養(yǎng)所需溫度在

4、0～45℃之間均可發(fā)育，不過(guò)以25～30 ℃之間的溫度來(lái)培養(yǎng)發(fā)育較佳,而以28～30℃培養(yǎng)為最好，較37℃時(shí)豐盛五倍， 至于在血液瓊脂平板上則以37℃為宜。,培養(yǎng)基的酸堿度在PH5.8～8.0均可發(fā)育，但以6.9～7.1為最適宜。,鼠疫桿菌在普通瓊脂平碟上，經(jīng)過(guò)24小時(shí)即能形成肉眼可見(jiàn)的薄薄一層淡灰色的微小菌落.直徑0.1～0.2毫米，有光澤、園形、中心稍凸出、 無(wú)色。顯微鏡下觀察可見(jiàn)碎玻璃片樣透明幼小菌落。培養(yǎng)48小時(shí)后，用顯微鏡觀察

5、時(shí)，能很清楚的看見(jiàn)非常透明而不整齊的化邊分布在菌落中心凸出部的周圍。菌落中心部呈顆粒狀，或者甚至呈小丘起伏狀，并呈淡黃色或稍呈黃褐色?；ㄟ厧О咨?，并且?guī)缀跏峭该鞯?。?8～30℃培養(yǎng)時(shí)菌落相當(dāng)干燥，容易用接種環(huán)從瓊脂表面將菌落取下來(lái)。,鼠疫菌的營(yíng)養(yǎng)需求,鼠疫菌是需氧或兼性厭氧的細(xì)菌，它在發(fā)育過(guò)程中不需要更多的氧，在培養(yǎng)基中添加血液、血紅素或其他還原物質(zhì)，改變培養(yǎng)基中的氧化還原電位以利鼠疫菌的發(fā)育，且血紅素又是合成呼吸酶的材料，有刺激鼠疫

6、菌生長(zhǎng)的作用。 近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)鼠疫菌在自然條件和實(shí)驗(yàn)條件下，都能發(fā)生變異而形成營(yíng)養(yǎng)缺陷型和低營(yíng)養(yǎng)型，其中又以氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型多見(jiàn)。,鼠疫檢驗(yàn)常用的培養(yǎng)基,1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基 常用的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰酶消化液瓊脂(即赫金格爾瓊脂)，其中以胰酶消化液瓊脂為優(yōu)。目前，國(guó)內(nèi)青海省地方病防治所有商品化的干粉可供選擇。2.敏感培養(yǎng)基 所謂敏感培養(yǎng)基，就是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，加入某種鼠疫菌生長(zhǎng)刺激劑而成的培養(yǎng)基。最常用的刺激劑有亞硫酸鈉和血

7、液。亞硫酸鈉一般多預(yù)先配成2.5％的水溶液，臨用時(shí)按每100毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1 毫升使培養(yǎng)基內(nèi)亞硫酸鈉的含量達(dá)到0.025％既可；血液一般習(xí)慣用家兔溶解血， 但以脫纖維兔溶解血更佳，用量以培養(yǎng)基內(nèi)含量達(dá)0.1--1％為合宜，于培基滅菌后冷至45℃左右時(shí)加入，混勻后傾注平皿。,3.選擇培養(yǎng)基 為了在腐敗材料中分離出鼠疫菌，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，加入某種能抑制雜菌生長(zhǎng)，但又無(wú)害于鼠疫菌生長(zhǎng)的物質(zhì)而制成的培養(yǎng)基稱之為選擇培養(yǎng)基。常用的是含

8、1/10萬(wàn)--1/20萬(wàn)的龍膽紫或結(jié)晶紫的培養(yǎng)基它能壓制變形菌的繁殖及一般腐敗菌的發(fā)育，尤其是在抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)上有一定的作用，而鼠疫菌在該培養(yǎng)基上24小時(shí)后仍可看到完整的菌落。 4.選擇敏感培養(yǎng)基 在優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，同時(shí)加入能刺激鼠疫菌生長(zhǎng)的刺激劑及抑制其他雜菌生長(zhǎng)的物質(zhì)之培養(yǎng)基稱為選擇敏感培養(yǎng)基。這一類培養(yǎng)基是鼠疫細(xì)菌檢驗(yàn)工作中最常用的，它包括龍膽紫溶解血培養(yǎng)基、龍膽紫亞硫酸鈉培養(yǎng)基。,所謂優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基就是培養(yǎng)基

9、內(nèi)氨基酸的含量豐富而且有鼠疫菌生長(zhǎng)所必需的種類，氨基氮含量不能低于50mg％，同時(shí)還需要有適當(dāng)?shù)拇碳?，鼠疫菌的最小接種量可以少到10個(gè)菌體也能長(zhǎng)出菌落來(lái)。另一方面培養(yǎng)基酸堿度必需準(zhǔn)確，PH6.9～7.1，培養(yǎng)基也要求新鮮潤(rùn)濕，要有一定的厚度，即要有平皿厚度的1/3 左右。,鼠疫菌的毒素,鼠疫菌毒性物質(zhì)在鼠疫菌的細(xì)胞內(nèi)部及莢膜中均可發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已證明鼠疫菌有兩種毒素，即鼠毒素和內(nèi)毒素。鼠疫菌的毒力和毒力決定子于鼠疫菌毒力多原性的理論，這

10、個(gè)概念的實(shí)質(zhì)在于鼠疫菌的毒力和某些性狀相關(guān)，毒力是鼠疫菌某些性狀的綜合表現(xiàn)，并把他研究的幾種抗原和特征稱為毒力決定子。,,現(xiàn)已證明的毒力決定子是：V和W毒力抗原(VW)、產(chǎn)生莢膜抗原(FraI)、色素沉著因子(Pgm)、鼠疫桿菌素I(PstI)、血漿凝固因子(F)， 后面三個(gè)因子顯然是互相聯(lián)系的。此外，有關(guān)鼠疫菌的毒力決定子還有嘌呤依賴(Pu)、鼠毒素(T)， 過(guò)氧化氫酶、五碳醣核酸酶和透明質(zhì)酸酶等。根據(jù)WHO鼠疫專家委員會(huì)第四報(bào)，

11、普遍被承認(rèn)的毒力決定子只有四個(gè)， 即：Fra1、VW、Pgm、Pst1。,,鼠疫菌的毒力常以最小致死量(MLD) 表示：即能引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部死亡的最小菌量?；蛴冒霐?shù)致死量(LD50)表示，即能引起試驗(yàn)動(dòng)物半數(shù)死亡的菌量來(lái)表示。 鼠疫菌的毒力可分為四種類型：即弱毒菌株、低毒菌株、毒菌株和強(qiáng)毒菌株。,鼠疫菌的抗原結(jié)構(gòu)和血清學(xué)特征,鼠疫菌有16種抗原，假性結(jié)核桿菌有13種抗原；在鼠疫菌和假性結(jié)核桿菌的抗原中有11種是兩菌共有的。 1.F1

12、抗原又稱莢膜FI（fraction I）抗原，是一種糖蛋白，分子量20000～500000，它至少可以分成4個(gè)亞單位，即F1A、F1B、F1Aa、F1Ba（分子量15000～17000）。是鼠疫菌在37℃培養(yǎng)時(shí)在菌體周圍生長(zhǎng)的一層封套物質(zhì)中的一部分，在37℃培養(yǎng)時(shí)F1抗原產(chǎn)生的多，在28℃培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生極少。F1抗原的抗原性較強(qiáng)，特異性較高，有白細(xì)胞吞噬作用，可用凝集、補(bǔ)體結(jié)合或間接血凝檢測(cè)。,,2.鼠毒素和內(nèi)毒素 3.毒力V/W抗原：在

13、細(xì)胞表面，V抗原是蛋白質(zhì)，可使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，W抗原為脂蛋白，不能使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)力。V/W抗原結(jié)合物有促使產(chǎn)生莢膜，抑制吞噬作用，并有在細(xì)胞內(nèi)保護(hù)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的能力，故與細(xì)菌的侵襲力有關(guān)。產(chǎn)生VW抗原的最適溫度是37℃，28℃培養(yǎng)時(shí)不產(chǎn)生此抗原。 4.抗原4和PH6抗原： 5.鼠疫桿菌素1(Pst1)。,鼠疫菌的質(zhì)粒,質(zhì)粒的定義：質(zhì)粒(Plasmid)是存在于細(xì)菌染色體以外的遺傳因子， 是環(huán)狀DNA， 能自主地進(jìn)行復(fù)制， 控制

14、著寄主細(xì)胞的一定遺傳性狀。 如：E.coli的F.R、COL因子等。 質(zhì)粒的表示單位：mdal(百萬(wàn)道爾頓)、Kb(一千堿基對(duì)) 1.4mdal=2.3Kb鼠疫菌質(zhì)粒的種類: 現(xiàn)已查明了鼠疫菌的某些毒力決定子是由質(zhì)粒控制的。鼠疫菌規(guī)范化的質(zhì)粒主要有：6mdal、45mdal、65mdal；其中6mdal質(zhì)粒編碼Pst1的產(chǎn)生；45mdal質(zhì)粒編碼VW；而65mdal質(zhì)粒決定F1抗原的產(chǎn)生。某一種質(zhì)粒的缺失可影響這一質(zhì)粒控制

15、的表型的表達(dá)。目前，質(zhì)粒已應(yīng)用于鼠疫菌的診斷和疫源地的分類等分子流行病學(xué)工作。如利用6mdal(9.5Kb)質(zhì)粒的pla基因上的456kb及65mdal(100Kb)質(zhì)粒caf1基因上的207Kb特異性片段用PCR技術(shù)來(lái)診斷鼠疫菌。,鼠疫菌的病原性,鼠疫菌的病原性，也就是鼠疫菌作為病原微生物的一個(gè)種它能引起鼠疫疾病的能力。人類不分膚色、種族、年齡、性別，普遍易感?？偟膩?lái)說(shuō)，鼠疫菌的病原性很強(qiáng)，其特點(diǎn)是有高度的攻擊性。在敏感動(dòng)物內(nèi)，鼠疫

16、菌很快地沿著淋巴管及血管擴(kuò)散，在臟器內(nèi)蓬勃的繁殖，并以敗血癥使動(dòng)物死亡。,鼠疫噬菌體,鼠疫噬菌體的應(yīng)用： 1.鼠疫菌的鑒定：由于鼠疫噬菌體在18～22℃時(shí)的噬菌作用具有種的特異性，即只能裂解鼠疫菌，故可用作鼠疫菌的鑒定方法之一。 2.鼠疫菌的快速診斷 3.判定檢材的間接指征,二、疑似鼠疫患者的取材（一）,1.1 疑似鼠疫病人應(yīng)在服用抗菌藥物前，依其癥狀和體征，按以下規(guī)定部位采取檢材。1.2 各型疑似鼠疫患者

17、，除采取相應(yīng)部位材料外，均應(yīng)采取靜脈血3～5mL，供檢菌和血清學(xué)診斷用。,1.3疑似腺鼠疫病人取材,1 選取腫大淋之淋巴結(jié)，用碘酒、酒精局部消毒，以左手姆指、食指固定，用滅菌注射器(12～16號(hào)針頭)刺入淋巴結(jié)，抽取組織液適量，保存于滅菌試管內(nèi)或直接接種于血瓊脂平板。2 淋巴結(jié)腫大不明顯者，可先向淋巴結(jié)內(nèi)注射0.3～0.5mL滅菌生理鹽水，稍停后再行抽取。3 感染后期，可在腫大的淋巴結(jié)周圍穿刺抽取組織液。,1.4疑似肺鼠疫病人取材,

18、1 令病人對(duì)血瓊脂平板咳嗽，或?qū)а狄簶?biāo)本收集于滅菌平皿或廣口瓶?jī)?nèi)備檢。2 用滅菌棉拭子涂擦咽部分泌物，將拭子保存于滅菌試管或滅菌生理鹽水管內(nèi)備檢。,1. 疑似鼠疫病人的取材（二）,1.5 疑似敗血型鼠疫應(yīng)采取靜脈血液1mL以上 1.6 疑似眼鼠疫應(yīng)用棉拭子或無(wú)菌毛細(xì)吸管，采取眼的分泌物。1.7 疑似腸鼠疫應(yīng)取病人糞便備檢。1.8 疑似皮膚型鼠疫取材。,,1.8疑似皮膚型鼠疫取材,1 水泡、膿泡期，可將膿泡表面用酒精消毒

19、，以滅菌注射器由泡的側(cè)面刺入泡內(nèi)，抽取內(nèi)容物備檢。2 潰瘍、結(jié)痂其以滅菌鑷子持滅菌棉球涂擦潰瘍面和痂皮下的創(chuàng)面，將棉球保存于滅菌試管或滅菌鹽水內(nèi)備檢。,1. 疑似鼠疫病人的取材（三）,1.9疑似腦膜炎型鼠疫的病人用腰椎穿刺法抽到腦脊液備檢。1.10對(duì)于鼠疫病人的密切接觸者，鼠疫污染材料的接觸者，以及早期未出現(xiàn)典型可疑癥狀的疑似鼠疫病人，均應(yīng)按1.2和1.4的規(guī)定取材備檢。,2.疑似鼠疫尸體的取材,2.1首例疑似鼠疫尸體應(yīng)作

20、解剖取材。2.1.1取材前應(yīng)作好解剖器材、場(chǎng)所選擇和尸體處理的準(zhǔn)備。2.1.2 以無(wú)菌手續(xù)采取肝、脾、肺、心血及有可疑病理改變的淋巴結(jié)等，分別置于滅菌平皿或試管內(nèi)保存。尸體有腐敗跡象時(shí)，必須取長(zhǎng)骨材料。2.2 如不能解剖，可行局部取材。用腰椎穿刺器按淋巴結(jié)、心、肝、脾及肺的順序穿刺采取組織，分別保存于滅菌試管內(nèi)，尸體腐敗時(shí)可穿刺取骨髓。,三、 動(dòng)物和昆蟲(chóng)材料的采集,3.1病死動(dòng)物的取材 3.2 一般動(dòng)物的取材 3.3 昆蟲(chóng)

21、材料的采集,3.1 病死動(dòng)物的取材,病死動(dòng)物、病鼠或疑為敵人撤放的活鼠，解剖取材時(shí)，先用常水或3％來(lái)蘇兒液將鼠體沾濕，以不流水為宜。不得將來(lái)蘇兒帶入臟器，然后按先皮下后胸腔，最后腹腔的順序解剖。采取腹股溝，腋窩等腫脹的淋巴結(jié)，肝臟、脾臟，肺臟和心血備檢。取材時(shí)宜采取有明顯病變的部位。每取完1個(gè)臟器后，剪刀、鑷子都要沿酒精火餡滅菌1次。 若臟器腐敗或殘缺不全，則應(yīng)取骨髓檢查，通常取股骨的骨髓。,3.2 一般動(dòng)物的取材,一般捕獲的活鼠及捕

22、獲時(shí)打死的鼠類，包括捕獲的其他種動(dòng)物或經(jīng)毒鼠藥毒死的鼠類及其他動(dòng)物。解剖時(shí)消毒方法與病死動(dòng)物相同，取材料時(shí)一般情況下只取肝、脾即可，取法同上。,3.3 昆蟲(chóng)材料的采集,蚤的染菌率高，鼠疫菌能長(zhǎng)期在蚤體內(nèi)保存，且蚤不易腐敗，易運(yùn)輸，并可大面積搜集。在某些情況下，檢查跳蚤比檢查嚙齒動(dòng)物能更快的發(fā)現(xiàn)疫源。 從病死鼠或捕獲鼠身收集的跳蚤以及在發(fā)現(xiàn)鼠尸附近的洞中采集跳蚤,均需仔細(xì)加以檢查。 供細(xì)菌檢查的蚤最好是活蚤，揀蚤時(shí)可將同一鼠體蚤梳入盛

23、有1／20萬(wàn)龍膽紫2％鹽水的蚤管內(nèi)，統(tǒng)一鑒定后作好記錄，檢查方法可分組或單匹取材 。,3.3.1．集組檢驗(yàn),當(dāng)檢獲大量蚤時(shí)，可按地區(qū)、宿主、蚤種進(jìn)行分組檢驗(yàn)，每組以15～20匹為宜，最多不超過(guò)50匹。分組后用滅菌生理鹽水洗滌3次，置于滅菌乳缽內(nèi)研碎，加少許生理鹽水研磨成懸液備檢。 3.3.2．單匹檢驗(yàn)單匹拉胃培養(yǎng)法 單匹壓碎培養(yǎng)法,材料的保存和送檢方法,3.凡所取材料均應(yīng)保存于滅菌器皿內(nèi)；組織塊可保存于滅菌生理鹽水中，或用5～10

24、mL Broke氏液保存；亦可應(yīng)用Cary Bleir培養(yǎng)基保存運(yùn)送材料。4.所取標(biāo)本按照衛(wèi)生部《人間傳染的病原微生物名錄》的規(guī)定進(jìn)行包裝。5.準(zhǔn)確詳細(xì)填寫送檢單。6.運(yùn)輸按照衛(wèi)生部《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》執(zhí)行7.接交材料時(shí)首先檢查包裝，絕對(duì)不能有破損、污染，如有破損應(yīng)立即消毒并報(bào)告有關(guān)單位處理。材料接交清單點(diǎn)清種類、數(shù)量，并準(zhǔn)確記錄簽字。,鼠疫細(xì)菌檢驗(yàn)程序及結(jié)果判定,1鼠疫細(xì)菌檢驗(yàn)基本

25、要求1.1鼠疫細(xì)菌檢驗(yàn)必須在衛(wèi)生部《人間傳染的病原微生物名錄》規(guī)定的相應(yīng)等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。1.2 檢驗(yàn)人員必須事前熟悉實(shí)驗(yàn)室管理制度，自身防護(hù)制度，技術(shù)操作規(guī)程等。1.3凡進(jìn)入毒菌室操作，必須兩人以上同時(shí)工作。1.4及時(shí)準(zhǔn)確做好檢驗(yàn)的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)記錄。,,,根據(jù)ws279-2008附錄B規(guī)定,,,,,,,,,,,,,,涂片染色結(jié)果觀察,典型的鼠疫桿菌短而粗、兩極濃染、兩端鈍園、中間澎大，幾乎成卵園或橢園形，菌體長(zhǎng)約1.

26、5～1.8微米，寬0.5～0.7微米。有莢膜、無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞。革蘭氏染色陰性。死于鼠疫的人尸和動(dòng)物尸體的新鮮臟器制備的涂片，可見(jiàn)到兩端鈍園，兩極濃染的典型鼠疫桿菌，呈散在或小堆，偶見(jiàn)鏈狀排列。在壓印標(biāo)本中，可以看到吞噬細(xì)胞內(nèi)外有鼠疫桿菌。此點(diǎn)對(duì)于鑒別雜菌污染材料有很大的價(jià)值，因?yàn)閯?dòng)物死后，污染的雜菌不會(huì)被吞噬細(xì)胞所吞噬。,3. 細(xì)菌培養(yǎng),3.1新鮮材料可直接涂布溶血(0.1%)赫氏瓊脂平板，按三段法劃法。3.2腐敗材料可劃線于龍

27、膽紫(1∶10萬(wàn)～1∶20萬(wàn))亞硫酸鈉(0.025%)平板或龍膽紫溶血平板。3.3液體材料及骨髓，用滅菌白金耳取標(biāo)本劃線。臟器材料先在平板表面壓印，再以白金耳劃線，棉拭子可直接涂布于培養(yǎng)基表面。3.4同一病人或尸體的不同材料可以分格涂于同一平板表面。每份材料接種一式兩個(gè)平板，一個(gè)作分離培養(yǎng)，另一個(gè)準(zhǔn)備做鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn)。3.5置28℃溫箱培養(yǎng)，于14～96h內(nèi)每日觀察發(fā)現(xiàn)具有鼠疫菌型形態(tài)的菌落。沒(méi)有嚴(yán)重污染的平板，必須持續(xù)培養(yǎng)

28、7d，無(wú)疑似鼠疫菌落出現(xiàn)時(shí)，始可棄去。,細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果觀察,鼠疫桿菌在普通瓊脂平碟上，經(jīng)過(guò)24小時(shí)即能形成肉眼可見(jiàn)的薄薄一層淡灰色的微小菌落.直徑0.1--0.2毫米，有光澤、園形、中心稍凸出、無(wú)色。顯微鏡下觀察可見(jiàn)碎玻璃片樣透明幼小菌落。培養(yǎng)48小時(shí)后，用顯微鏡觀察時(shí)，能很清楚的看見(jiàn)非常透明而不整齊的花邊分布在集落中心凸出部的周圍。菌落中心部呈顆粒狀，或者甚至呈小丘起伏狀，并呈淡黃色或稍呈黃褐色?；ㄟ厧О咨?，并且?guī)缀跏峭该鞯摹?4.

29、鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn),4.1 在3.4中用于噬菌體裂解試驗(yàn)的平板上，于劃線一側(cè)滴噬菌體一滴，傾斜平板使其垂直流過(guò)劃線。4.2 分離培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)可疑鼠疫菌落時(shí)，用白金耳取可疑菌落重新劃線于血瓊脂平板，再依上法滴加鼠疫噬菌體。4.3 置28℃溫箱，24h觀察有無(wú)噬菌現(xiàn)象，噬菌帶于噬菌體流過(guò)的痕跡時(shí)，方可判定為鼠疫噬菌體試驗(yàn)陽(yáng)性。,5. 動(dòng)物接種（一）,5.1 病人、尸體材料，特別是腐敗材料必須在進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的同時(shí)接種小白鼠(18～20

30、g)或豚鼠(250～300g)。5.2 臟器塊，置于消毒乳缽內(nèi)，用滅菌剪刀剪碎并研成勻漿，加入適量生理鹽水，制成懸液備用。5.3 新鮮材料可用腹腔或皮下接種，豚鼠接種0.5～1.0mL，小白鼠接種0.2～0.4mL。 5.4 腐敗材料可采用經(jīng)皮接種，剃去動(dòng)物腹毛，并造成輕微劃痕，將材料以棉拭子涂布于剃毛之皮膚上并擦之，涂擦?xí)r應(yīng)以平皿蓋，以防材料四濺。5.5 接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，做好標(biāo)記，放入飼養(yǎng)籠內(nèi)，掛牌記載編號(hào)、接種日期、途徑等

31、。每日飼養(yǎng)1～2次，直至動(dòng)物死亡或7d后然殺死剖檢。5.6 動(dòng)物死亡后，按3和4進(jìn)行檢驗(yàn)。 ,5. 動(dòng)物接種（二）,5.7 如7d動(dòng)物沒(méi)有死亡，應(yīng)處死動(dòng)物，取動(dòng)物的脾臟及有可疑病變組織制成勻漿，接種第2組動(dòng)物，動(dòng)物死亡或7d后處死，按5.6檢驗(yàn)，同時(shí)采集血清，做被動(dòng)血凝試驗(yàn)。無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)方可做出陰性報(bào)告。,6. 鼠疫菌判定依據(jù),6.1 分離獲得鼠疫菌落，并按4.3的標(biāo)準(zhǔn)判定鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn)陽(yáng)性時(shí)，始可做出鼠疫細(xì)菌學(xué)判定。負(fù)責(zé)檢驗(yàn)

32、的單位應(yīng)在噬菌體裂解試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生后24h內(nèi)將鼠疫菌鑒定報(bào)告報(bào)送負(fù)責(zé)部門。并對(duì)過(guò)去所做的疑似鼠疫報(bào)告做出認(rèn)定或訂正報(bào)告。6.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，由死亡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)重新分離到鼠疫菌，并經(jīng)噬菌體裂解試驗(yàn)證實(shí)，負(fù)責(zé)檢驗(yàn)的單位應(yīng)做出鼠疫強(qiáng)毒菌的鑒定報(bào)告,判定鼠疫菌的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù),———————————————————————————————————————————————————— 菌體形 　培養(yǎng)特性　 鼠疫噬菌體　 動(dòng)物試驗(yàn) 　

33、分析判定　態(tài)特點(diǎn)　　　 　　　裂解試驗(yàn)（18～20℃） ———————————————————————————————————————————————————— ＋ －　　　　－ － 否　　　定 ＋ ＋ － 　　 ?。?重試仍為此結(jié)果

34、的可否定 ＋ ＋ 　 ＋ 　　 　 －　　　 判　　　定 ＋ ＋ ＋ 　　　 ＋ 　 　 判　　　定 － ＋ 　 ?。?＋ 判　　　定

35、 － ＋ ＋ 　　 　 － 　 　判　　　定 　 －　　 －　　　 ?。　　　??。?疑似，在培養(yǎng)基中　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加抗鼠疫噬菌體血清 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　再進(jìn)行試驗(yàn)————————————————————————————————————————————————

36、————,鼠疫血清學(xué)檢驗(yàn),一. 間接血凝試驗(yàn)(PHA) 二. 反向血凝試驗(yàn)（RPHA）一. 間接血凝試驗(yàn)(PHA （一）適用范圍 （二）被檢材料（三）試劑（四）操作步驟（五）結(jié)果判定,（一）適用范圍,疑似鼠疫病人在急性期間及恢復(fù)期間，以及具有可疑鼠疫病史的人應(yīng)取其靜脈血進(jìn)行間接血球凝集試驗(yàn)，以檢查血液中是否具有抗鼠疫菌F1抗體。（二）被檢材料各型鼠疫患者均應(yīng)采取靜脈血3～5mL，分離血清。被檢血清均應(yīng)56℃30m

37、m滅活供診斷用。,（三）試劑,2.5%F1抗原致敏血球。 1%正常兔血清鹽水。2.5%單寧酸血球。F1抗原液(50～100μg/mL)。,（四）操作步驟（一）,1. 取小試管(15mm×100mm)兩列，第一列第一管加入1%正常兔血清鹽水0.9mL，其余各管各加0.5mL，為血凝抑制列，第二列的各管加入0.25mL，為血球凝集列。2. 取被檢血清0.1mL加入第一列的第一管，進(jìn)行雙排并列倍比稀釋如表C1所示，第一

38、管混勻后，吸取0.75mL，其中0.25mL加入第二列第一管內(nèi)，0.5mL加入第一列的第二管中，混勻后，再吸取0.75mL，依次如前稀釋，直至最后一管，棄0.5mL。,（四）操作步驟（二）,3. 第一列每管內(nèi)各加入0.25mLF1抗原液(50～100μg/mL)，混勻后置37℃溫箱10～15min。4. 于各管內(nèi)加入2.5%F1抗原致敏而球一滴(0.05mL)，混勻后置37℃溫箱，2h后觀察結(jié)果。 5. 試驗(yàn)同時(shí)設(shè)下列對(duì)照管：

39、a) 1%正常兔血清鹽水0.5mL+2.5%F1抗原致敏血球0.05mL；b) 1%正常兔血清鹽水0.5mL+2.5%單寧酸血球0.05mL；c) 1∶20被檢血清0.5mL+2.5%單寧酸血球0.05mL；,（五）結(jié)果判定,1. 各對(duì)照管不應(yīng)呈現(xiàn)疑集。2. 第二列為試驗(yàn)更，根據(jù)血球凝集程度分為下列幾種：a) “#”凝集血球鋪滿管底，有明顯折邊，抗體過(guò)量時(shí)，凝集呈疏松花圈狀；b) “+++”凝集血球鋪滿管底，無(wú)折

40、邊；c) “++”血球不完全凝集，管底呈整齊的圓圈，但圈內(nèi)外有非常明顯的血球凝集；d) “+”管底形成較小的圓圈，在圈內(nèi)外只有很少的血球凝集。,著裝程序,1.穿內(nèi)隔離衣褲，2.戴白帽和小口罩，3.扎三角頭巾，4.穿防蚤襪及長(zhǎng)筒膠靴，5.穿后開(kāi)口的白大衣(偏衫)，6.戴20～24層的紗布大口或?yàn)V材口罩，7.戴醫(yī)用手術(shù)手套，必要時(shí)外面套細(xì)線手套，8.進(jìn)行已知毒菌動(dòng)物接種、解剖或菌種開(kāi)封等工作應(yīng)戴有機(jī)玻璃面罩或眼鏡，以防

41、操作時(shí)細(xì)菌濺入眼內(nèi)或臉部裸露皮膚。,卸裝程序,工作完畢外出前將雙手(戴著手套的)浸于3 ％的來(lái)蘇兒液內(nèi) 1～3 分鐘。外出后立即鎖門并到第二更衣室按下列順序卸裝及消毒： ①.脫線手套、脫口罩、(脫眼鏡)脫工作服、脫三角頭巾、脫膠手套、分別浸泡于消毒液內(nèi)。②.在2 ％來(lái)蘇兒內(nèi)洗手。③.脫膠靴、防蚤襪及隔離衣褲。④.用肥皂、清水洗手。⑤.用酒精棉球擦手。⑥.用3％硼酸水漱口。,鼠疫實(shí)驗(yàn)室生物安全與技術(shù)規(guī)范,一.結(jié)構(gòu)上分四個(gè)等級(jí)