大鼠灌注固定取腦,解剖取材

1、大鼠灌注固定取腦,主講：陳爽 2017.9.12,用途1.用于常規(guī)HE染色，免疫組化分析。2.冰凍切片可以不做腦組織固定。3.不可用于western blot和PCR。4.如果觀察腦組織的缺血、損傷或其它病變時(shí)，不作灌注 固定，而是在取出腦組織后作固定，將大大影響效果。,原理

2、 心臟灌流術(shù)能夠快速?zèng)_凈血液并在動(dòng)物死 亡前進(jìn)行組織的前固定,避免了組織的自溶 現(xiàn)象,是腦組織切片觀察的常用方法。多聚 甲醛使組織蛋白發(fā)生交聯(lián)，以保持蛋白的 原位和表面結(jié)構(gòu)不變，從而能使其對(duì)應(yīng)的抗體，準(zhǔn)確檢測(cè)其表達(dá)的位置和量。,必要性1.腦組織較軟，且細(xì)胞成分不易保留，腦組織是較易軟化的組織之一，血供 也較為豐富，所以最好是在取腦組織前用4％多聚甲醛灌注固。2.經(jīng)前固定后，取腦操作時(shí)，可減少腦組織損傷。3.腦

3、內(nèi)血液都在，HE染色后，可去除紅細(xì)胞背景影響,流程麻醉 開(kāi)胸 心尖向左心室穿針 剪開(kāi)右心耳 生理鹽水沖洗 4%多基甲醛固定 取腦 保存或切片.,,,,,,,,具體過(guò)程 大鼠經(jīng)深度麻醉后，固定于自制的手術(shù)木板置于解剖盤中,開(kāi)胸暴露并游離出

4、心臟,經(jīng)左心室插入灌流針并固定, 切開(kāi)右心耳,先灌注冰凍無(wú)菌生理鹽水(4℃)XmL，直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清,后再灌注冰凍(4℃)4%多聚甲醛XmL,斷頭取腦,多聚甲醛浸泡固定24小時(shí)。,1.多聚甲醛的配置：一般方法為：4％多聚甲醛PBS緩沖液配法：稱取40g PFA溶于裝有500mlDEPC水的玻璃容器燒杯或燒瓶）中，持續(xù)加熱磁力攪拌至60～65℃，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮

5、狀（滴加），再加入約500ml PBS，充分混勻（在冰浴或冷水浴中），可再檢測(cè)一下pH，過(guò)濾后定容至1000ml，室溫或4℃保存?zhèn)溆?。?jiǎn)便方法：先配好PBS，稱好相應(yīng)的多聚甲醛，37℃水浴或溫箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期間不時(shí)震蕩。注意，4%的多聚甲醛需臨用前配制,配制后需過(guò)濾去除小的雜質(zhì),避免心臟灌流時(shí)造成栓塞影響灌流效果。也可用10%福爾馬林溶液，甲醛1：10稀釋 甲醛100m

6、l 磷酸二氫鈉4g 磷酸氫二鈉6.5g 蒸餾水900ml 或甲醛100ml加900mlPBS緩沖液。,2.制作灌注裝置，用兩瓶塑料包裝的輸液瓶裝灌注液。同時(shí)配好輸液器備用。3.10％水合氯醛按4mL/100g的劑量腹腔注射麻醉動(dòng)物。4.沿兩側(cè)肋弓剪開(kāi)皮膚，打開(kāi)腹腔，用止血管鉗夾持劍突并向上提拉，用彎剪在膈肌與胸骨柄相連處剪一小口，造成人工氣胸，然后向兩側(cè)順延，剪斷膈肌及肋骨，

7、夾持劍突的血管鉗將劍突連帶胸廓上翻固定，充分暴露心臟，直視下穿刺針左心室心尖處，用血管鉗固定。5.快速滴注生理鹽水(室溫)，同時(shí)剪開(kāi)右心耳。約注入100~150mL，至流出液體血色較淺基本澄清，停止灌注。肝臟、眼珠、爪子迅速變白是排出血液的有效觀察指標(biāo)。6.繼續(xù)用4%多聚甲醛灌流250ml固定。7.后固定：灌流后的腦組織置于4％PFA置4度冰箱內(nèi)進(jìn)行后固定，時(shí)間>2h，過(guò)夜最好,省時(shí)省劑的方法 夾閉腹主動(dòng)脈

8、：只灌注上肢及頭腦，固定 的好又快，又省試劑。先灌注生理鹽水 約100ml，見(jiàn)到老鼠兩前肢及兩肺變白即可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的標(biāo)志：剛開(kāi)始灌注時(shí)老鼠前肢劇烈抽動(dòng)（下肢不抽動(dòng)證明腹主動(dòng)脈夾閉完全）；前肢及頸部僵硬；所灌注的腦組 織白而硬,大鼠腦組織取材步驟,1.剪開(kāi)皮膚,2.用鉤鑷再眼眶處固定大鼠顱骨，用組織剪再顱骨和頸椎連接處剪斷,3.組織剪頭部伸

9、入枕骨大孔，盡量貼著骨頭（不能插太深傷到腦組織）。,4.組織剪從枕骨大孔處伸入，朝向同側(cè)眼眶方向，貼著骨頭剪，剪到眼眶,5.從大鼠眼眶之間剪斷,6.左手持鉤鑷插入大鼠的眼眶固定顱骨，用彎鉗直接夾住枕骨大孔處的骨頭直接就掀起來(lái)了,從小腦處將腦組織向上推起，用小剪刀剪斷腦神經(jīng),注意事項(xiàng)1.多聚甲醛氣味刺激，配置時(shí)做好自我保護(hù)。2.暴露心臟這一步驟，容易損傷肺、心臟或者肝臟，“夾持劍突并向上提拉，用彎剪在膈肌與胸骨柄相連處剪一小口，造成

10、人工氣胸”，人工氣胸后，肺萎縮，胸腔里的空間增大，提拉劍突后，不容易損傷肺、心及肝臟，出血少。3.經(jīng)心臟灌注，有時(shí)穿刺針會(huì)誤進(jìn)右心室，那樣灌注主要在肺循環(huán)起作用，體循環(huán)的血液影響不大。所以觀察將穿刺針插入到主動(dòng)脈內(nèi)可以確保起到體循環(huán)灌注沖洗血液的效果，腦組織的血液沖干凈后，才不會(huì)影響免疫組化的效果，不然到處都是紅細(xì)胞造成的背景染色。4.灌注時(shí)注意排空輸液管中的氣泡，不然容易氣栓，影響灌注效果。一定要看到大鼠較劇烈抽搐，不然證明灌

11、注不好。,5.關(guān)于生理鹽水的溫度的選擇，有人認(rèn)為因?yàn)槭强焖贈(zèng)_刷血管里的血液，低溫造成血管收縮，灌注的效果反而沒(méi)有室溫的好。但是用低溫的認(rèn)為，低溫有利于組織完整。6.灌注成功的標(biāo)志：剛開(kāi)始灌注時(shí)老鼠劇烈抽動(dòng)；成功后老鼠后肢繃直，尾部豎起成一直線；所灌注的腦組織白而硬。7.去顱骨后腦表面有一層硬腦膜,要去掉。,常見(jiàn)問(wèn)題,1.灌注取腦不可用于Western blot及PCR的原因,多聚甲醛使組織蛋白發(fā)生交聯(lián)，以保持蛋白的原位和表面結(jié)構(gòu)

12、不變，從而能使其對(duì)應(yīng)的抗體，準(zhǔn)確檢測(cè)其表達(dá)的位置和量。Western中，要用去污劑使各種蛋白發(fā)生變性、解聚，并變成統(tǒng)一的線性肽鏈，從而能夠用凝膠電泳進(jìn)行分子量的梯度分離。多聚甲醛會(huì)影響蛋白的解聚，從而使其無(wú)法用凝膠分離。 另外，WB和免疫組化所使用抗體的抗原表位也不同，WB的抗體一般識(shí)別蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，所以可能也無(wú)法識(shí)別甲醛處理的蛋白。PCR要提RNA，RNA非常容易降解，必須新鮮取組織，然后盡快超低溫冷藏或者馬上抽提，否則非常容易

13、降解。灌注固定的組織，原則上是能夠提得出DNA和RNA的，但是肯定會(huì)有較多的降解，一般不會(huì)這樣做。,2.沒(méi)有灌注固定的大鼠腦組織,能不能做切片和免疫組化？,如果沒(méi)有灌注固定，而是直接取材然后放入固定液中，可以進(jìn)行免疫組化染色，只是效果不如灌注固定的好尤其是要做電鏡時(shí)更明顯。有的標(biāo)記蛋白要求較高，固定不好就難以染好。,3.用4%多聚甲醛固定但保存了2周才做石蠟切片，對(duì)免疫組化有無(wú)影響？,固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)蛋白多肽鏈都交連在一起了,抗原性就很

14、弱了，很可能沒(méi)有陽(yáng)性結(jié)果,抗原修復(fù)時(shí)一般的修復(fù)很難把抗原性恢復(fù). 可能會(huì)有影響，但不會(huì)太大。固定時(shí)間長(zhǎng)，抗原修復(fù)時(shí)間也要長(zhǎng)一些。,4.灌注多長(zhǎng)時(shí)間？灌注液多少？,每個(gè)人的灌注液用量都不一樣，灌注速度也能沒(méi)有很清楚的說(shuō)法，灌注時(shí)間也不確定。主要還是看灌注成功的標(biāo)志?，F(xiàn)將看到的比較詳細(xì)的處理方法列出。灌注速度，大家比較公認(rèn)的是先快后慢。,短期灌注：采用心臟穿刺快速灌注20 min,其中生理鹽水灌注50~100mL,4 %多聚甲醛緩沖液灌

15、注150 mL。長(zhǎng)期灌注：灌注時(shí)間延長(zhǎng)到1 h,其中生理鹽水灌注200mL,4 %多聚甲醛緩沖液灌注400 mL。 短期灌注組腦組織結(jié)構(gòu)保留基本良好,與長(zhǎng)期灌注組相比稍差,研究皮層和海馬結(jié)構(gòu)損傷基本可以滿足;長(zhǎng)期灌注組結(jié)構(gòu)保留最好,但是耗時(shí)長(zhǎng)、固定液用量大,致使試驗(yàn)進(jìn)度慢等缺點(diǎn)不容忽視。,對(duì)皮層和海馬缺血再灌注損傷研究選擇短期灌注取腦尚可滿足需要,深部腦白質(zhì)及核團(tuán)缺血再灌注損傷研究還是要用長(zhǎng)期灌注固定取腦法,或者在取腦后立即根據(jù)

16、實(shí)驗(yàn)取材要求將腦切成塊再浸泡入固定液充分固定。下面是夾閉腹主動(dòng)脈:每只大鼠先快速推注生理鹽水50 ml沖洗,繼而灌注固定液(如4%多聚甲醛等)50~80 ml,先快后慢,需10~15 min,在灌注固定液過(guò)程中,頸部逐漸變硬;灌注結(jié)束后,開(kāi)顱取出腦組織,置于固定液中后固定24 h,5.體循環(huán)與肺循環(huán)的鑒別,體循環(huán)時(shí)大鼠肝臟變白現(xiàn)象出現(xiàn)較早,在灌注多聚甲醛后,四肢會(huì)出現(xiàn)明顯的抽搐現(xiàn)象,尾巴和四肢明顯僵硬。若灌流針誤插入右心室,會(huì)導(dǎo)致