缺血再灌注大鼠腦微血管損傷機(jī)制研究.pdf

1、缺血性腦卒中是老年人的常見(jiàn)疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點(diǎn)。且每年都呈上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人類健康，并給社會(huì)和家庭造成沉重的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。在卒中的治療方面，溶栓治療是目前公認(rèn)有效的治療措施。但由于該方法時(shí)間窗短，繼發(fā)腦出血風(fēng)險(xiǎn)大，限制了其在臨床上應(yīng)用。對(duì)于腦保護(hù)的研究成為目前腦卒中研究的熱點(diǎn)之一，將溶栓治療和腦保護(hù)治療結(jié)合在一起是今后卒中治療的方向。
　　 目前對(duì)于缺血性腦卒中的腦保護(hù)治療多集中在改善腦部循環(huán)、抗

2、自由基、抗興奮性氨基酸等方面，而微血管的損傷可加重腦水腫，引起梗死后出血轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子進(jìn)一步釋放，形成炎癥的發(fā)大和正反饋。因此微血管構(gòu)成的血腦屏障結(jié)構(gòu)在缺血性腦卒中神經(jīng)損害中起至關(guān)重要的作用，日益成為缺血性腦卒中治療的新的靶點(diǎn)；同時(shí)Rho激酶是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，Rho/Rho激酶系統(tǒng)可通過(guò)下游效應(yīng)因子對(duì)細(xì)胞的分裂、收縮、粘附、遷移、分泌等活動(dòng)具有重要調(diào)節(jié)作用，在缺血性腦血管病中，Rho/Rho激酶系統(tǒng)可以促進(jìn)

3、炎性因子釋放，介導(dǎo)缺血后炎癥反應(yīng)發(fā)生。目前對(duì)于Rho激酶在缺血性腦卒中介導(dǎo)微小血管損傷及具體機(jī)制探討少有相關(guān)研究報(bào)道。
　　 本研究旨在運(yùn)用線拴法制備大鼠缺血再灌注模型通過(guò)觀察不同時(shí)間點(diǎn)Rho激酶、S100B、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)之間表達(dá)相關(guān)性及與腦微血管損傷的關(guān)系，探討Rho激酶通過(guò)調(diào)節(jié)S100B、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)而介導(dǎo)了大鼠缺血再灌注后微血管的損傷，為Rho激酶成為缺血性腦卒中微血管損傷新的靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依

4、據(jù)。
　　 第一部分缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)Rho激酶表達(dá)的變化及與微血管損傷的關(guān)系
　　 目的：觀察大鼠缺血再灌注模型(MCAO)不同時(shí)間點(diǎn)Rho激酶表達(dá)的變化及與微血管損傷的關(guān)系。
　　 方法：將在我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得的雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、MCAO6、24、48、72h模型組，每組各15只。并分別運(yùn)用線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞的缺血再灌注6、24、48、72h模型。本部分試驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR

5、檢測(cè)假手術(shù)組、MCAO組缺血90分鐘再灌注6、24、48、72h Rho激酶mRNA水平的變化，并于各再灌注時(shí)間點(diǎn)處死大鼠后取梗死側(cè)缺血半暗帶腦組織測(cè)定伊文思藍(lán)(EB)含量來(lái)觀察血腦屏障的通透性的改變；免疫組化染色及層粘蛋白(Laminin)表達(dá)水平測(cè)定，并觀察他們之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分缺血再灌注6、24、48、72h四組與假手術(shù)組相比，有顯著差異(P＜0.01)；各模型組之間神經(jīng)功能評(píng)分相比較無(wú)顯著差異

6、(P＞0.05)。Rho激酶mRNA表達(dá)、EB含量、Laminin表達(dá)在各組間差異均具有顯著性(P＜0.05)；缺血再灌注6、24、48、72h四組與假手術(shù)組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。Rho激酶mRNA表達(dá)、EB含量均于缺血再灌注的早期(6h)開始逐漸升高，在再灌注48h時(shí)達(dá)到高峰，此后逐漸下降；Laminin表達(dá)在缺血再灌注的早期開始逐漸下降，在再灌注48h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，此后逐漸上升。Rho激酶mRNA表達(dá)與EB含量呈直線相

7、關(guān)，r=0.925，P=0.025＜0.05；Rho激酶表達(dá)與Laminin表達(dá)直線相關(guān)，r=-0.955，P=0.011＜0.05； EB含量與Laminin表達(dá)直線相關(guān)，r=-0.982，P=0.003＜0.01。
　　 結(jié)論：在缺血再灌注不同時(shí)間Rho激酶的表達(dá)和微血管損傷之間具有相關(guān)性。
　　 第二部分缺血再灌注大鼠腦微血管損傷的機(jī)制探討
　　 目的：選取缺血90分鐘再灌注24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)Rho激酶抑

8、制劑干預(yù)，觀察S100B、MMP-9表達(dá)的變化及關(guān)系，初步探討Rho激酶介導(dǎo)微血管損傷中的的發(fā)生機(jī)制；并觀察Rho激酶抑制劑對(duì)大鼠缺血再灌注微血管損傷的保護(hù)作用。
　　 方法：將在我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得的雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、MCAO模型組、Rho激酶抑制劑干預(yù)組，同實(shí)驗(yàn)第一部分制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞的缺血再灌注24h模型。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定法檢測(cè)三組中大鼠缺血半暗帶腦組織S100B蛋白、MMP-

9、9 mRNA水平的變化及關(guān)系；觀察Rho抑制劑干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、伊文思藍(lán)含量、Laminin表達(dá)水平、腦組織含水量，并與假手術(shù)組、MCAO模型組作對(duì)照。
　　 結(jié)果：大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、EB含量、Laminin表達(dá)水平、腦組織含水量，在缺血再灌注24h組較假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.05)；Rho激酶抑制劑組與缺血再灌注24h組相比差異有顯著性(P＜0.05)。缺血半暗帶腦組織S100B蛋白、MMP-9 mRN