抗體的制備

1、抗體的制備,李成仁組織學與胚胎學教研室,一、一些基本概念,1. 克隆(clone)是指無性繁殖細胞系，是由單一個祖先細胞分裂繁殖而形成的一簇細胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。細胞克?。河梢粋€細胞增殖而成的細胞集團,抗原(antigen，Ag),2. 抗原決定簇 是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，又稱表位(epitope)，抗原結(jié)合位點,Ag,,,,,,,,,1,2,3,4,3.單

2、克隆抗體 (Monoclonal Antibody, McAb) 由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。4.多克隆抗體 (Polyclonal Antibody，pAb) 用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物。,Ag,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,單克隆抗體,B1,B2,B3,B4

3、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,B3,B3,B3,B3,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2,多克隆抗體,3,4,,,,,1,,,,,,,,,,,,單克隆抗體的特點,抗體的性質(zhì)相同，容易純化、標記。特異性強，具有抗原結(jié)合位點的專一性。(不是抗原的專一性！)因結(jié)合位點的單一性，有時不易捕捉抗原，一株單克隆抗體與抗原不易產(chǎn)生凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)。,但單克隆抗體有交叉反應(yīng) 是由于不同的抗原上有完全相同的表位(10

4、0%的交叉反應(yīng))，或有相似的表位(不同程度的交叉反應(yīng))。,多克隆抗體的特點,多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質(zhì)是一個群體綜合的性質(zhì)。特異性一般比單抗差 因為由不同性質(zhì)的抗體組成，只要其中含交叉反應(yīng)的抗體，多抗就有交叉反應(yīng)，所以多抗更容易有交叉反應(yīng)。,比單抗更容易捕捉抗原。 因為含有抗不同表位的抗體，多種抗 體都可與抗原結(jié)合。,抗體的純化、標記比單抗難 因為含有各種不同類型、亞類的抗體， 提純、標記的方法有

5、所差別。同時，血 清中含有的雜蛋白比較多。,購買抗體時要注意廠商的標注,適合于做什么實驗，使用濃度多少WB（Western blotting ，免疫印跡)IHC (Immunohistochemistry, 免疫組織化學)ICC (Immunocytochemistry, 免疫細胞化學)IEM (Immunelectron microscopy,免疫電鏡)FCM (Flow Cytometry,流式細胞儀)ELISA(

6、enzyme linked immunosorbent assey, 酶聯(lián)免疫吸附實驗，酶聯(lián)免疫分析),抗體的制備技術(shù)經(jīng)歷了三代：第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）；第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工

7、程抗體(genetic engineering antibody)。,抗體制備技術(shù),一、多克隆抗體制備（一）免疫原的制備（二）免疫動物（三）免疫血清的純化（四）免疫血清的鑒定（五）免疫血清的保存二、單克隆抗體制備（一）單克隆抗體制備原理,（二）單克隆抗體制備的技術(shù)要點（三）影響雜交瘤技術(shù)的因素（四）單克隆抗體的應(yīng)用三、基因工程抗體技術(shù)（一）人源化抗體（二）小分子抗體（三）雙特異性抗體（四）抗體庫技術(shù),抗體制備

8、技術(shù),二、多克隆抗體制備,(一)免疫原的制備免疫原(immunogen)指能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞的抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity）免疫原—天然抗原、人工合成抗原； 蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原,1. 顆粒性抗原的制備 (1)紅細胞抗原的制備： A、新鮮血經(jīng)無菌NS洗滌3次，取壓積紅細胞并配制成2~5%，直接進行注射免疫。 B、新鮮

9、血+抗凝劑— 4℃保存4W，免疫前取適量抗凝綿羊血，按A處理。 C、新鮮血去除纖維蛋白原后按B處理。,(2)細菌抗原的制備：取標準菌株，接種。 H抗原：取有動力的菌株液，用0.3~0.5%甲醛處理。 O抗原：菌液于100℃2.5h。 Vi抗原：殺菌后，加入1%的氯化鈣溶液。(3)蟲卵也可作為抗原，例如日本血吸蟲卵懸液。,(4)組織細胞粗抗原：所用的組織必須是新鮮或處理后低溫(-40℃)保存的。器官或組織

10、材料得到后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織及大血管，用無菌NS進行灌注、洗滌至沒有殘血、污物，在冷浴中將組織剪成小塊后粉碎(勻漿)/消化。,粉碎方法有兩種，一是高速組織搗碎機法：注意要高速(1萬rmp)，間斷(每次30秒~1min)進行，時間過長會導致產(chǎn)熱，破壞抗原。另一種是研磨法(有時加入洗過的海沙使研磨更有效)。勻漿液經(jīng)離心，沉淀中含大量的組織細胞和碎片，上清液可提取可溶性抗原。消化是用胃蛋白酶或胰酶，通過酶解將細胞間質(zhì)消化，獲得游

11、離單個細胞。,,2. 可溶性抗原的制備 可溶性抗原可分為：細胞膜蛋白抗原、細胞漿抗原、細胞核及核膜抗原。(1)細胞破碎：有如下方法： A、反復(fù)凍融法：置-15~-20 ℃凍結(jié)，然后緩慢融化，反復(fù)2次，大部分細胞因胞內(nèi)冰晶的形成和溶劑濃度的突然改變而被融破。此法適用于組織細胞，對微生物的細胞作用較差。,B、冷熱交替法：將材料投入沸水中，90 ℃左右維持數(shù)分鐘，立即置于冰浴中。在細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)及核酸可用此法。C、超聲波破

12、碎法：是利用超聲波的機械振動而使細胞破碎的方法。微生物和組織細胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子則較難打破。,D、酶處理法：酶在一定的條件下能消化細菌和細胞。例如在堿性(pH8.0)下，溶菌酶可專一破壞G+菌細胞壁。此法適用于多種微生物。 E、表面活性劑處理：在一定的條件下，表面活性劑能與細胞膜脂蛋白形成微泡，使膜的通透性發(fā)生改變而使細胞破碎。提取核酸時常用此法。F、自溶法：利用組織和微生物的自身酶系，在一定條件下使細胞溶解。,,(2)

13、蛋白質(zhì)抗原的制備：破碎的細胞按一定要求純化，可獲得不同成分的抗原。A、超速離心法：利用各抗原在梯度液中沉降速度不同，達到區(qū)帶分離的目的。這是分離亞細胞部分和蛋白質(zhì)大分子的有效手段。,B、選擇性沉淀：是采用各種沉淀劑或改變條件使抗原成分沉淀而達到分離的目的。a、核酸除去法：用DNA/RNA酶降解或用氯化錳/硫酸魚精蛋白/鏈霉素作沉淀劑去除核酸。b、鹽析沉淀法：用不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉。例如:用40、35、33%的硫酸銨分次提取或

14、用20%硫酸鈉提取，即可獲得丙種球蛋白(含IgG 95%以上) 。,c、有機溶劑沉淀法：有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導致溶解度降低而沉淀，有些有機溶劑能破壞蛋白質(zhì)的水化膜而使蛋白質(zhì)沉淀，例Cohn地溫酒精可將血漿蛋白分為五組。IgG屬CohnⅢ。d、其它沉淀劑：常用聚乙二醇(PEG)和硫酸葡聚糖。PEG濃度3~4%可沉淀IC，6~7%沉淀IgM，8~12%沉淀IgG，12~15%沉淀其它球蛋白，2

15、5%則沉淀白蛋白。,C、凝膠層析法：利用凝膠的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分子在凝膠顆粒間很快通過，小分子進入網(wǎng)孔，難于洗脫，將抗原分為大、中、小三種。屬區(qū)帶分離法。D、離子交換層析：利用帶離子基團的纖維或凝膠，吸附帶相反電荷的抗原。,,凝膠過濾層析( 分子篩)的作用機理,E、親和層析：利用生物學分子間所具有的專一親和性而設(shè)計的層析方法。Ag-Ab, 激素-受體，酶-酶配體，酶蛋白-輔酶。,親和層析的作用機理,,(3)核酸抗原的制備：細胞破碎液去

16、除蛋白質(zhì)(常用酚和氯仿抽提)后，用沉淀劑(常用乙醇)沉淀核酸。(4)脂多糖抗原的制備：苯酚提取法。(5)Ig片段的制備：酶裂解法—Fc、Fab 氧化/還原法：輕、重鏈。,(6)純化抗原的鑒定： 鑒定蛋白的含量、相對分子的質(zhì)量、 純度以及免疫學活性。蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等）分子的質(zhì)量—電泳、質(zhì)譜蛋白的純度—電泳等免疫學活性—免疫雙擴散、免疫

17、印跡,(二)半抗原免疫原的制備：利用某些功能 團將半抗原連接到載體上。1、載體的選擇：A、蛋白質(zhì)：人/牛/兔白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和血藍蛋白等。最常用牛白蛋白。B、多肽聚合物：多為人工合成(多聚賴氨酸)。C、大分子聚合物和某些顆粒：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，羧甲基纖維素，活性碳，乳酸等,2. 連接方法：半抗原與載體的連接有物理法和化學法。物理法：用吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附

18、載體主要有PVP和CMC等；化學法：利用某些功能基團把半抗原連接到白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進行連接。,A、碳化二亞胺法 B、戊二醛法C、氯甲酸異丁酯法 D、琥珀酸酐法E、0-羧甲基羥胺法 F、一氯醋酸鈉法G、重氮化的對氨基苯甲酸法,(三)佐劑：與抗原同時或預(yù)先注射于機體，能增強機體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)，稱為佐劑。1、佐劑的條件：A、增加抗原的表面積，并改

19、變抗原的活性基團構(gòu)型，從而增加抗原的免疫原性。,B、與抗原結(jié)合能延長抗原在局部組織中的存留時間，達到持續(xù)刺激基團產(chǎn)生高效價的抗體。C、 可以激活免疫活性細胞，增強體液免疫、細胞免疫和非特異免疫功能。D、 無毒、無副作用。,,2、常用佐劑的種類和制備：A、鋁乳：5%硫酸鋁+5%NaOH，反應(yīng)后NS洗滌沉淀2次以上。1:1與抗原混合。B、明礬：硫酸鉀鋁在一定pH下產(chǎn)生氫氧化鋁膠體。制備方法是：Ag+NS，攪拌下緩慢滴入10%的硫酸鋁

20、鉀溶液，以NaOH校正pH至6.5，離心、NS洗滌。,C、福氏佐劑：分為不完全佐劑(石蠟油+羊毛脂)和完全佐劑(石蠟油+羊毛脂+卡介苗)。1:1與抗原混合研磨均勻即可。但完全福氏佐劑局部注射因易形成肉芽腫和持久潰瘍而不用于人體免疫。,(四)免疫動物,為獲取高質(zhì)量(特異性強和效價高)的抗體，除了需制備質(zhì)量好純度高的抗原外，還需選擇適宜的動物和設(shè)計有效可行的免疫方案，如抗原的劑量、劑型、注射途徑、注射次數(shù)、注射間隔和接種動物的年齡均與免疫效

21、果密切的關(guān)系。,1. 用于免疫的動物：主要根據(jù)抗原的生物學特性和所要獲得抗體數(shù)量來選擇。①抗原來源與動物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。②動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。③抗原性質(zhì)與動物種類。,兔子(rabbit)：最常用于

22、自制抗體，抗體量較多。最好用純種新西蘭兔， 大耳白，體重以2～3kg為宜。小鼠(mouse)：可用于自制抗體，但 抗體量很少。一般用BALB/C和昆明鼠大鼠(rat)：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動物。常用Wistar大鼠,,羊(sheep、goat)：常用于較大批量地 生產(chǎn)抗體(商品)。馬（horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用抗體（商品）。豚

23、鼠(guinea pig)：國外實驗室常用。,2. 免疫途徑,免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。,1、基礎(chǔ)免疫：首次抗原劑量大， 300～500μg，用福氏完全佐劑。2、加強免疫：第2次以后，抗原量為首次劑量的1/4～1/2，用福氏不完全佐

24、劑，每2～4周加強免疫一次，多次。,（三）免疫的基本步驟,3、取血測效價：加強免疫兩次或三次以后的第7天取血。制備血清，檢測抗體效價。如未達到預(yù)期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止。當抗體效價達到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。,免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測效價 酶聯(lián)法：1:104以上，能達到1:106。 免疫雙擴散：1:16以上，能達到1:64效價達到要求的可放血制備血清 可一次放血(頸動脈或心臟)

25、也可多次取血(耳靜脈) 放血過程中要嚴格按無菌要求進行。,圖1 頸動脈分離圖,抗體反應(yīng),4、放血制備血清：最后一次免疫后7-10天放血。在三角瓶中加一些生理鹽水，放血后室溫下放置1h左右讓血液凝固，置4℃下過夜(切勿冰凍)析出血清，吸取血清，離心， 4000rpm，10min。在無菌條件，吸出血清，分裝(0.05～0.2ml)，貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4℃冰箱保存。,1、效價：就是指血清中所含抗體的濃度或含量。常用放射

26、免疫法，對所有的抗體均適用。某些由大分子抗原所產(chǎn)生的抗體，也可用雙擴散法測定。前者極為精確，而后者粗糙。(1)放射免疫法：以不同稀釋度的抗體與優(yōu)質(zhì)標記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度為效價。,（四）抗體質(zhì)量的評價,(2)雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。中央孔內(nèi)加適量抗原(容量為50μl)，周圍各孔內(nèi)分別加入50μl

27、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度,2、特異性或?qū)Ｒ恍裕菏侵缚贵w對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。通常，以交叉反應(yīng)率來表示的。3、親合力：是指抗體與抗原結(jié)合的活度或牢固度。親合力的高低是由抗原分子的大小、抗體分子的結(jié)合位點與抗原決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。,(五)免疫失敗的可能原因及措施,(1)免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變

28、動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數(shù)量。 (2)抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進提取方法。,(3)制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑、載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進。(4)所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。,(5)免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。 (6)動物的飼養(yǎng)是否得當，

29、如營養(yǎng)(飼料、飲水)、環(huán)境衛(wèi)生(通風、采光、溫度)是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。,五、免疫血清的保存,1、4℃保存（6個月）2、低溫保存（-70 ℃ ～-20 ℃ ，5年）3、真空干燥保存（5 ～ 10年）注意點：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑 避免反復(fù)凍融（分裝）,四、單克隆抗體的制備,單抗 多抗抗體組成

30、 單一 復(fù)雜 抗體性質(zhì) 個體的屬性 群體綜合的性質(zhì)純化標記 容易，效果好 難度高一些 種屬來源 絕大多數(shù)是小鼠 兔子、羊、豚鼠等制備周期 長 (最短4個月） 短（2個月）制備技術(shù) 復(fù)雜

31、 簡單經(jīng)費 多 少,,,,,,,,,,一、雜交瘤技術(shù)的原理及流程,(一)動物的選擇,多選用純種bala/c小鼠。,7～12周齡20g～25g體重,(二)免疫動物,應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定，一般在融合前兩個月左右開始免疫。,初次免疫：皮下多點注射或脾內(nèi)注射，加福氏完全佐劑,,3W,第二次免疫：皮下或腹腔內(nèi)注射，加福氏不完全佐劑,

32、,3W,第三次免疫：腹腔內(nèi)注射，不加佐劑。,,采血測其效價,5～7D,,加強免疫：腹腔內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射,,2～3W,3D,取脾融合,(1)可溶性抗原免疫原性較弱 ，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細胞因子作為佐

33、劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，增強免疫細胞對抗原的反應(yīng)性。,(2)顆?？乖庖咝詮?，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。初次免疫1×107/0.5ml腹腔內(nèi)注射 ↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml腹腔內(nèi)注射 ↓3周后加強免疫(融合前三天)1×107/0.5ml腹腔內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射 ↓ 取脾融合,（

34、二）細胞融合,1、細胞融合前準備(1)骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量單抗。,最常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653,小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代 。每3～5天傳代一次。細胞在傳代

35、過程中，部分細胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進行處理。,(2)飼養(yǎng)細胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細胞。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3t3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。,巨噬細胞,2．細胞融合的步驟(1)制備飼

36、養(yǎng)細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞，與免疫小鼠相同品系的小鼠。,(2)制備免疫脾細胞最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次計數(shù)取108脾淋巴細胞懸液備用,（3）制備骨髓瘤細胞取對數(shù)生長骨髓瘤細胞離心用無血清培養(yǎng)液洗2次計數(shù)，取得×107細胞備用（4）融合①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不

37、完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm，8min，棄上清。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。,②90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%聚乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。③加37℃預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止聚乙二醇作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。④離心，800rpm, 6min。⑤充上清，用含20%小牛血清hat選擇培養(yǎng)液重懸。⑥將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96孔板內(nèi)

38、，每孔加100μl。⑦將培養(yǎng)板置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,聚乙二醇PEG是最常用的細胞融合劑。PEG可能的作用機理： PEG導致細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合。PEG的細胞融合作用完全是隨機發(fā)生的。一般選用分子量4000 的PEG作為細胞融合劑。不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同。,(三)選擇雜交瘤細胞及抗體檢測,1、 HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤細胞：,H(Hypoxant

39、hine, H)次黃嘌呤； A(Aminopterin)氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T(Thymidine, T)胸腺嘧啶核苷；供細胞通過替代途徑合成DNA。,骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能在hat選擇培養(yǎng)液中生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，可以生長繁殖。,在用hat選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，hat選擇培養(yǎng)液維持7～10

40、天后應(yīng)換用ht培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液 。,2、抗體的檢測：檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：(1)放射免疫測定：可用于可溶性抗原、細胞單抗的檢測。(2)酶聯(lián)免疫吸附試驗可用于可溶性抗原、

41、細胞和病毒等單抗的檢測。(3)免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的單抗的檢測。(4)其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。,（四）雜交瘤的克隆化,是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過hat篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆，可能會有數(shù)個克隆。原則是，對于檢測陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟

42、失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。,1、有限稀釋法克隆(1)克隆前1天制備飼養(yǎng)細胞層。(2)將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。(3)調(diào)整細胞為3～10個細胞/ml。(4)取頭天準備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100 μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。(5)在第7天換液，以后每2～3天換液1次 。(6)8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。(7)將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。(8)

43、每個克隆應(yīng)盡快凍存。,（五）雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇,及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。,（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn),大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：（1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低 ，一般培

44、養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，費用較高。,（2）體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。①實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小后（一 般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。,②腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml pristane (降植烷)或液體石蠟于bal

45、b/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。,思考題,1. 什么是多克隆抗體和單克