靶向Axl抗體的制備與鑒定.pdf

1、目的：受體酪氨酸激酶作為細胞跨膜蛋白，在惡性腫瘤細胞的信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要的作用，參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、粘附、增殖和遷移等多個生理過程。因此受體酪氨酸激酶是癌癥治療和藥物研發(fā)的熱門分子靶點。Axl是受體酪氨酸激酶TAM家族成員之一，Axl及其配體Gas6在許多惡性腫瘤中都有高表達。近年來，Axl/Gas6作為癌癥治療的新靶點引起了廣泛關(guān)注。單克隆抗體藥物以其特異性強、安全性高、毒性低、臨床療效好等優(yōu)點，在腫瘤靶向治療中發(fā)揮重要作用。針對

2、Axl靶點開發(fā)特異性候選抗體藥物，將為腫瘤臨床治療提供更多選擇。
　　方法：本研究通過雜交瘤技術(shù)制備靶向Axl功能性單克隆抗體。借助生物信息學、結(jié)構(gòu)生物學對Axl胞外段進行序列、結(jié)構(gòu)分析，將Axl參與與Gas6相互作用的功能域基因克隆到pGEX-4T-1表達載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，以IPTG誘導、表達并純化獲得目標蛋白。利用目標蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過細胞融合、雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng)，利用ELISA、

3、流式細胞術(shù)、Western印跡等實驗進行抗體篩選；釣取目標抗體基因，進行基因序列比對分析；進一步通過競爭ELISA、抑制增殖、劃痕實驗、遷移實驗等實驗評價抗體體外生物學活性。
　　結(jié)果：
　　1、抗原的制備
　　對人 Axl胞外段進行序列、結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果提示 Axl胞外區(qū)的Ig-like-C2-type-1(27-128aa)為 Gas6識別的功能域。將包含 Axl全長中第27-128aa(F1)的基因克隆到表達載體p

4、GEX-4T-1中，構(gòu)建 pGEX-4T-1-F1表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，優(yōu)化后獲得GST-F1可溶性表達并親和純化；經(jīng) SDS-PAGE電泳和 Western印跡等實驗方法鑒定，表達純化獲得的蛋白為預期的GST-F1融合蛋白，為免疫動物制備單克隆抗體奠定了基礎。
　　2、抗Axl mAb的制備、篩選和鑒定
　　GST-F1融合蛋白免疫 BALB/c小鼠后進行雜交瘤融合，以 GST-F1融合蛋白進行ELIS

5、A篩選，同時以GST蛋白進行負性篩選，挑取特異性識別 GST-F1而不與 GST蛋白結(jié)合的抗體克隆。進一步結(jié)合流式細胞篩選，最終獲得2株穩(wěn)定分泌抗Axl mAb的雜交瘤細胞株（8-11，16-7）。擴大培養(yǎng)雜交瘤細胞8-11、16-7，制備小鼠腹水，經(jīng)純化獲得抗體。利用小鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒分析，顯示2株抗體株抗體的重鏈亞類為IgG3，輕鏈為κ型。ELISA結(jié)果顯示，篩選得到的2株抗Axl mAbs不僅可以特異性識別GST-F1抗

6、原，同時可以特異性識別真核表達的Axl胞外段與人 IgG-Fc融合蛋白（Fc-Axl-ECD）；利用 Axl高表達的細胞株進行Western Blot以及流式細胞分析，結(jié)果顯示篩選得到的2株抗Axl mAbs可以特異性識別天然表達的Axl蛋白。
　　釣取了2株抗體的基因并測得基因序列，所得序列在 GenBank中與抗體核酸序列進行比對分析，結(jié)果顯示2株抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)序列與提交的小鼠 IgG可變區(qū)序列的同源性均超過96％，

7、確定基因序列為抗體序列；分析抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，確定抗體的FR區(qū)和 CDR區(qū)。
　　3、抗Axl單克隆抗體體外生物學活性
　　競爭ELISA、抑制增殖、劃痕實驗、遷移實驗等實驗結(jié)果顯示，獲得的兩株抗Axl單克隆抗體具有良好的體外生物學活性。競爭ELISA的結(jié)果顯示，抗Axl mAb能特異性競爭Gas6結(jié)合Axl蛋白。借助Axl高表達的MDA-MB-231細胞進行抗體生物學活性評價，結(jié)果顯示抗Axl mAb使內(nèi)源性的Ax

8、l含量減少，并同時抑制其磷酸化，抑制增殖實驗結(jié)果顯示，篩選獲得的抗 Axl mAb對 MDA-MB-231細胞的增殖無明顯影響；Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果顯示，抗 Axl mAb抗體能顯著抑制MDA-MB-231細胞遷移能力。
　　結(jié)論：
　　1、通過計算機模擬分析，確定人Axl與Gas6相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，并經(jīng)原核表達、純化，獲得了純度較高的GST-F1的融合蛋白片段。
　　2、通過雜交瘤技術(shù)獲得了2株特