抗瘦素納米抗體的篩選及制備.pdf

1、瘦素是一種與能量代謝、免疫、生殖等相關(guān)的多功能細胞因子，其在血液中的含量異常會導(dǎo)致肥胖、營養(yǎng)不良、心血管疾病、腫瘤、肝病等多種疾病，特別是終末期腎衰患者廣泛存在瘦素水平過高的問題，由此導(dǎo)致腎衰癥患者營養(yǎng)不良、高血壓、胰島素抵抗等并發(fā)癥，這些并發(fā)癥嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，因此開發(fā)特異性抗體實現(xiàn)瘦素水平的檢測與去除將具有非常重要的臨床意義。納米抗體由于其諸多優(yōu)良特點，成為該方面研究的最佳選擇。獲得足夠量的抗原是進行抗體篩選的前提，由于血液

2、中瘦素含量較低，本論文首先進行了瘦素的制備，然后進行抗體的篩選。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴瘦素制備。根據(jù)人瘦素氨基酸序列，構(gòu)建了原核表達載體pET23a-leptin，優(yōu)化后的表達條件:活化的菌體以1％轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基后，恒溫搖床37℃連續(xù)培養(yǎng)8h，期間不加入IPTG。瘦素以包涵體形式存在于大腸桿菌中，通過包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性、強陰離子交換色譜，最終獲得純度95％的重組人瘦素蛋白。⑵納米抗體篩選。通過五輪篩選，從瘦素免疫噬菌

3、體庫和非免疫庫中分別得到18種和5種特異性納米抗體序列，因有一序列重復(fù)，最終得到22種。經(jīng)Elisa方法檢測，選取其中結(jié)合活性較高的6種進行后續(xù)表達純化。⑶納米抗體表達。利用PCR、雙酶切等手段構(gòu)建6種納米抗體的表達載體，轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli Shuffle T7進行表達。除納米抗體A11表達量較低外，納米抗體A5、A12、A23、A33和B1表達量均可占總蛋白30％，且有可溶性表達。選擇A5、A33進行表達純化，得到純度達90％的納