標(biāo)記免疫分析課件

1、第八章 體外分析技術(shù),體外分析技術(shù)是一組超微量體外分析技術(shù)的總稱，它是利用某種特異性結(jié)合劑與被測(cè)物和標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，從而對(duì)極微量物質(zhì)進(jìn)行定量分析的分析技術(shù)。 1960年Berson和Yalow首次應(yīng)用放射免疫分析法（RIA）測(cè)定胰島素，開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測(cè)定的新時(shí)代，是微量分析方法學(xué)上的一大突破。本章主要以RIA為例介紹這類方法的基本原理及方法特點(diǎn)。,第一節(jié) 放射免疫分析,一、基本原理：放射免疫分析（radi

2、o immunoassay，RIA）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應(yīng)用最廣的一類技術(shù)，其基本原理為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。即：放射性標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)抗原）共同與特異性抗體發(fā)生可逆性結(jié)合，如圖8-1。這種競(jìng)爭(zhēng)可用以下反應(yīng)式來(lái)表達(dá)：,Ag + Ab → AgAb+Ag*↓Ag*Ab,式中Ag *代表標(biāo)記抗原，Ag代表非標(biāo)記抗原，Ab代表特異性抗體，Ag * Ab代表標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，AgAb代表非標(biāo)記抗原抗體

3、復(fù)合物。,當(dāng)反應(yīng)體系中同時(shí)存在Ag、Ag *和Ab，而Ag *的量一定、Ab的量限定（分子數(shù)少于抗原）時(shí)，隨著Ag的增加，Ag * Ab的量相應(yīng)減少，即與Ag（包括標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)抗原）的量呈負(fù)相關(guān)競(jìng)爭(zhēng)性抑制。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，將反應(yīng)體系中的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物與游離的標(biāo)記抗原分離，測(cè)定其放射性。以標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的結(jié)合率（B/T、B/F、B/B0）為縱坐標(biāo)，繪制劑量效應(yīng)曲線（calibration curve）

4、，也稱標(biāo)準(zhǔn)曲線。,試劑盒組成：（以T4測(cè)定為例）1、Ag (系列標(biāo)準(zhǔn)品)，濃度分別為： 0、20、40、80、160、320ng/ml2、Ag*，125I-T4（紅色，作為示蹤劑）3、Ab， 抗T4抗體（作為結(jié)合劑）4、分離劑（免疫分離劑，結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡后將結(jié)合部分與游離部分分開）,0 20 40 80 160 320 待1 待2,加樣：1、Ag（系列標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品）50ul/每管2、Ag*

5、 200ul/每管3、Ab 100ul/每管混勻，37℃ 45分鐘，加分離劑離心，測(cè)定結(jié)合部分放射性。,放射免疫分析的幾種標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：,抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律，即：,當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。設(shè)KA為平衡結(jié)合常數(shù)，也稱親和常數(shù)，則有：,k1和k2分別代表結(jié)合速度常數(shù)和解離速度常數(shù)，[Ag]、[Ab]、[AgAb]分別代表游離抗原、游離抗體和抗原抗體復(fù)合物的濃度。假設(shè)Ab0和Ag0

6、分別代表抗原、抗體的初始濃度，B和F分別代表反應(yīng)平衡時(shí)結(jié)合和游離抗原的%，（以分?jǐn)?shù)表示，B+F=1），可以推導(dǎo)出B的函數(shù)式，,由上式可看出是以B為函數(shù)的一元二次方程。對(duì)每一特定的RIA系統(tǒng)，[ Ab0]和KA是固定的，[*Ag0]也是固定的，所以B在直角坐標(biāo)上隨非標(biāo)記[ Ag0]呈雙曲線走向。,二、基本試劑（一）、抗體（antibody）(1)、抗體的制備：抗體是體外放射分析中應(yīng)用最廣的結(jié)合劑，是用純化的免疫原免疫動(dòng)物制備而得，免

7、疫的成敗在于免疫原和動(dòng)物種類以及注射途徑、佐劑的使用、注射劑量和時(shí)間等。,分子量超過(guò)5000的蛋白多肽物質(zhì)具有較好的免疫原性，容易刺激高活度的抗體形成。分子量小于5000的肽類物質(zhì)免疫原性低，需要與載體蛋白結(jié)合方能引起明顯的抗體形成。應(yīng)該指出，動(dòng)物對(duì)抗原的免疫反應(yīng)個(gè)體差異很大，當(dāng)一批動(dòng)物用同樣的免疫原和免疫程序進(jìn)行免疫時(shí)，往往只有部分動(dòng)物產(chǎn)生滿意的反應(yīng)。,（2）抗血清（antiserum）的質(zhì)量鑒定： 評(píng)價(jià)結(jié)合劑的主要

8、指標(biāo)有滴度、特異性和親和力。,1）滴度測(cè)定： 測(cè)定方法是將抗血清稀釋成不同濃度，分別加入一定量的標(biāo)記抗原，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下達(dá)到平衡后，分離B與F，計(jì)算不同稀釋度的抗血清與標(biāo)記抗原的結(jié)合百分率，以結(jié)合百分率為縱坐標(biāo)，以抗血清稀釋度為橫坐標(biāo)，繪制抗血清稀釋曲線（如圖）。,選擇結(jié)合率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的稀釋度，作為該結(jié)合劑的稀釋度，該稀釋度即為滴度。抗體滴度越高表明抗體的質(zhì)量越好。,2）特異性測(cè)定：抗血清的特異性是指抗體與待測(cè)物以外的結(jié)構(gòu)類

9、似物結(jié)合的程度（又稱交叉反應(yīng)率）。 交叉反應(yīng)百分率 =[Y]50/[Z]50×100% 其中[Y]50為被測(cè)物結(jié)合率50%時(shí)的濃度值；[Z]50為結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合率50%時(shí)的濃度值。干擾輕者特異性高。,3）親和力和親和常數(shù)測(cè)定：親和力表示特定的抗原、抗體之間的結(jié)合能力，常用親和常數(shù)KA來(lái)表示。KA越大，表示抗原、抗體之間結(jié)合能力越強(qiáng)，B/F值大，方法的靈敏度高。

10、 隨著單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）技術(shù)的發(fā)展，提高了現(xiàn)代體外分析技術(shù)的特異性和親和力。,（二）、放射性標(biāo)記物 放射性標(biāo)記物是體外放射分析的測(cè)量依據(jù)，常用的標(biāo)記核素有125I和3H。 對(duì)標(biāo)記物的質(zhì)量要求包括： （1）比活度（specific activity）：體外放射分析法的定量范圍一般在10-9-10-12mol水平，標(biāo)記物的用量應(yīng)等于或小于被測(cè)物的最小量，以得到較

11、好的靈敏度。高比活度的標(biāo)記物是確保分析方法靈敏度的前提。,（2）放化純度（radiochemical purity）：一般要求標(biāo)記物的放化純度在95%以上，若放射性雜質(zhì)過(guò)多，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率降低，將會(huì)影響測(cè)定的靈敏度。（3）免疫活性（immune activity）：標(biāo)記物在標(biāo)記和儲(chǔ)存等過(guò)程中會(huì)造成損傷，使標(biāo)記抗原的免疫活性下降，與抗體發(fā)生反應(yīng)的能力減弱，甚至喪失，因此抗原活性的檢測(cè)十分重要。要求標(biāo)記抗原與待測(cè)抗原具有相同的免疫活性。,

12、（4）穩(wěn)定性（stability）： 穩(wěn)定性是指標(biāo)記抗原在合理儲(chǔ)存的條件下，保持其全部性能不變的程度。許多因素可影響其性能的穩(wěn)定性，如標(biāo)記方法、標(biāo)記位置、置換水平、理化環(huán)境等都可使放射性核素從標(biāo)記抗原的分子上脫落下來(lái)，或造成標(biāo)記分子聚合或解離，使放化純度明顯下降。當(dāng)標(biāo)記方法合理，保存條件完善時(shí)，貨架期可達(dá)1-3月。,（三）、標(biāo)準(zhǔn)品（calibration standard） 標(biāo)準(zhǔn)品是樣品定量的基礎(chǔ)，它的質(zhì)

13、和量的變化會(huì)直接影響樣品的測(cè)定值。 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的要求包括：（1）標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)物質(zhì)應(yīng)屬同一物質(zhì)；（2）在與結(jié)合劑發(fā)生反應(yīng)時(shí)，應(yīng)與待測(cè)配體有相等的活性和親和力；（3）高度純化，不含影響分析的雜質(zhì)；（4）標(biāo)準(zhǔn)品的定量一定要準(zhǔn)確。,四、分離技術(shù) 在放免分析中，當(dāng)抗原、抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，必須將B與F分離，分別測(cè)定其放射性。理想的分離技術(shù)應(yīng)兼?zhèn)湟韵聨c(diǎn)：（1）將B與F盡可能完全分離，并且不改變最初的平衡狀態(tài)；

14、（2）B與F的分離不易受血漿或血清等外界因素的干擾；（3）分離試劑廉價(jià)易得，操作簡(jiǎn)便、分離迅速、重復(fù)性好。幾種常用的分離技術(shù)介紹如下：（一）沉淀法（precipitation method） 也稱PEG法。溶解于水中得蛋白質(zhì)，其分子周圍有水化層，以此保持蛋白質(zhì)在水中得穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)分子吸水能力的大小取決于蛋白質(zhì)分子電荷的多少。,在一般RIA中，反應(yīng)體系PH值多為中性附近，接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，γ球蛋白所帶的電荷很少，形成水化層的能力較弱

15、，當(dāng)加入適當(dāng)濃度的聚乙二醇或堿金屬中性鹽如硫酸胺等奪取其周圍的水分子，使它失去水化層，從而將抗體γ球蛋白（B）沉淀下來(lái)，與游離部分的抗原分離。這種分離方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，分離迅速，價(jià)格低廉，但是，這種方法易受環(huán)境溫度、pH值、離子強(qiáng)度和蛋白質(zhì)含量的影響，并且有些抗原也可能被同時(shí)沉淀下來(lái)，所以，非特異性結(jié)合高。,（二）雙抗體法（double antibody method） 在RIA中，當(dāng)抗原、抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，由于抗

16、原抗體復(fù)合物的濃度很低，而且處于可溶性狀態(tài)，不能直接通過(guò)離心的方法加以分離。于反應(yīng)體系中加入第二抗體，形成抗原-第一抗體-第二抗體復(fù)合物，通過(guò)離心將B與F分離開來(lái)。雙抗體法為一種特異性的分離方法，非特異性結(jié)合低，但主要缺點(diǎn)是分離時(shí)間長(zhǎng)，第二抗體用量多等。,Ag,,,Ab1,,,Ab2,Ag · Ab1 Ab1 · Ab2Ag · Ab1 · Ab2,（三）雙抗體-PEG法（double a

17、ntibody-PEG method） 這種方法是目前被廣泛采用的一種方法，它兼顧了雙抗體法和PEG法各自的優(yōu)點(diǎn)，克服了雙抗法分離時(shí)間長(zhǎng)和沉淀法非特異性結(jié)合高的缺點(diǎn)，并且使第二抗體和PEG的用量大為減少，在常溫加入分離劑后，無(wú)需溫育，直接離心，可獲得滿意的結(jié)果。（四）吸附分離法（adsorptive separation method） 應(yīng)用經(jīng)過(guò)特殊處理的吸附劑，將游離的小分子抗原或半抗原吸附，經(jīng)過(guò)離

18、心，隨著吸附劑的沉淀，將F沉淀下來(lái)，而抗原-抗體復(fù)合物分子大，不被吸附，仍保留在溶液中，從而將B與F分離開。常用的吸附劑有葡聚糖包被的活性炭（DCC），離子交換樹脂等。,（五）固相分離法 這種分離法是將抗原或抗體通過(guò)特殊技術(shù)聯(lián)結(jié)在固相載體上，免疫反應(yīng)在固相載體上完成，達(dá)到平衡后形成固相的抗原-抗體復(fù)合物，可與游離部分分離。固相分離技術(shù)的方法較多，比如，試管固相法：將抗體IgG直接包被于試管底部，使用時(shí)將非標(biāo)記抗原和標(biāo)記抗

19、原加入試管，抗原與包被在管底的抗體結(jié)合達(dá)到平衡後，棄去上清（F），洗滌后測(cè)定反應(yīng)管（B）的放射性即可。固相分離技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、迅速，分離效果好，非特異性結(jié)合低，是一種比較有前途的分離方法。,（六）磁化分離技術(shù)（magnetizing separation technique） 磁化分離法是將磁化材料引入RIA體系，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，借助磁力將B與F分離，從而省去了離心的步驟。（七）微孔濾膜法（millipor

20、e filter method） 微孔濾膜法通常采用醋酸纖維素濾膜或玻璃纖維素濾膜，在放免反應(yīng)達(dá)到平衡后，將反應(yīng)液加入裝有微孔濾膜的濾器上，抗原抗體復(fù)合物保留在濾膜上，游離部分被濾掉。,五、數(shù)據(jù)處理（標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合） RIA的數(shù)據(jù)處理是以標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果為依據(jù)，擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品的濃度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線是衡量樣品的客觀尺度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式要慎重選擇，使它能夠真實(shí)的反應(yīng)測(cè)量的結(jié)果，減少人為因素

21、的引入。目前常用的方式為數(shù)學(xué)模型法。1、Logit-Log模型 Logit-Log轉(zhuǎn)換是使雙曲線直線化的最常用方法。它是將標(biāo)準(zhǔn)品濃度轉(zhuǎn)換成Log濃度，作為橫坐標(biāo)，而把B轉(zhuǎn)換成LigitB，LigitB=LogBx/（B0-Bx）。其中B0是0劑量結(jié)合率，Bx是任何劑量為X時(shí)的結(jié)合率（如圖）：,可以看出，這是一條隨劑量增加而下降的直線。這種方法的缺點(diǎn)是：由于劑量取對(duì)數(shù)，0劑量在擬合時(shí)不用，所以靈敏度有損失；如果反應(yīng)系統(tǒng)不是理想模式，

22、用本方法處理將有較大偏差。2、四參數(shù)Logistic模型 四參數(shù)Logistic模型是國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)（IAEA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的數(shù)據(jù)處理模型，是對(duì)Logit-Log模型的發(fā)展。其通式為：,其中X是抗原劑量，Y是結(jié)合%，a、b、c、d為四個(gè)參數(shù)。對(duì)RIA來(lái)說(shuō)，a可取實(shí)驗(yàn)所得的最大結(jié)合率B0，b可取同一批數(shù)據(jù)用Logit-Log法作線性回歸所得的斜率，c可取使B0下降一半所需抗原濃度ED50，d可取實(shí)驗(yàn)所得NSB。四參

23、數(shù)Logistic模型的圖形如圖：,3、其他擬合模型 如四參數(shù)單位點(diǎn)作用模型的穩(wěn)定性較好，個(gè)別標(biāo)準(zhǔn)管出現(xiàn)壞點(diǎn)對(duì)擬合結(jié)果的影響較小；還有二次多項(xiàng)式擬合法、折線擬合法等。應(yīng)當(dāng)指出，不論采用何種數(shù)學(xué)模型進(jìn)行曲線擬合，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果應(yīng)該是相同的或相近的，都不能改善實(shí)驗(yàn)過(guò)程低劣所帶來(lái)的影響。,六、RIA的分析誤差和質(zhì)量控制,RIA是一類高靈敏度的超微量分析技術(shù)，易受各種因素的影響而使檢測(cè)結(jié)果失真。因此，質(zhì)量控制體系應(yīng)包括生產(chǎn)及使用兩

24、個(gè)重要環(huán)節(jié)。作為生產(chǎn)廠家，應(yīng)建立嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)程序，以保證進(jìn)入市場(chǎng)的產(chǎn)品都符合質(zhì)量要求，這是首要環(huán)節(jié)。作為用戶則應(yīng)建立嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系，以保證檢測(cè)的質(zhì)量。根據(jù)不同的目的，質(zhì)量控制體系可分為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制和實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。,（一）誤差的來(lái)源 按誤差發(fā)生的統(tǒng)計(jì)學(xué)性質(zhì)可將其分為：1、系統(tǒng)誤差（systematic error） 這種誤差常表現(xiàn)為檢測(cè)結(jié)果呈傾向性的偏高或偏低，是一些可以確定的因素導(dǎo)致的。（1）方法誤差，如標(biāo)

25、準(zhǔn)品稀釋體積不正確；（2）儀器和試劑誤差，如儀器狀態(tài)不佳；量器不準(zhǔn)；（3）操作誤差，如不正確的操作習(xí)慣等。 系統(tǒng)誤差是可以通過(guò)努力消除的。,2、隨機(jī)誤差（random error） 這種誤差是由偶然因素所引起，誤差的出現(xiàn)是隨機(jī)的，與真值的偏差是雙向的。常見的原因如加樣誤差，由分離劑或離心機(jī)造成的錯(cuò)分誤差等。 （二）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制（internal quality control） 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制

26、側(cè)重對(duì)檢測(cè)質(zhì)量的控制，它保證從收集樣本開始到發(fā)出報(bào)告為止的全過(guò)程中，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的各種誤差，分析產(chǎn)生的原因，找出糾正的辦法，以確保檢測(cè)的質(zhì)量。常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)有精密度、準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、有效性。,1、精密度（precision） 精密度是指在相同的條件下，對(duì)某一樣品多次檢測(cè)所得結(jié)果的符合程度，即重復(fù)性。RIA系統(tǒng)的精密度是首先和隨時(shí)應(yīng)考慮的，是最重要的質(zhì)量參數(shù)。評(píng)價(jià)方法如下：（1）、標(biāo)準(zhǔn)誤差（SD）和變異系數(shù)

27、,2、準(zhǔn)確度（accuracy） 準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真值的符合程度?？己朔铣潭鹊膶?shí)踐往往需要多份測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。準(zhǔn)確度、精密度之間的關(guān)系：,1．準(zhǔn)確度、精密度均好。2．準(zhǔn)確度較好，精密度差。3．準(zhǔn)確度差，精密度好。4．準(zhǔn)確度、精密度均差。,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常用回收實(shí)驗(yàn)，健全性試驗(yàn)，“零”水平測(cè)定等評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。附回收率（recovery rate）的測(cè)定：（1）回收率：回收率是反應(yīng)測(cè)定值偏差的質(zhì)控指標(biāo)，測(cè)定方法是設(shè)

28、回收管和對(duì)照管，對(duì)照管中加入待測(cè)樣品，回收管中加入待測(cè)樣品和已知量的分析物，經(jīng)過(guò)測(cè)定全過(guò)程，比較已知量和測(cè)得量之間的一致程度，理論上回收率一般為90%-110%之間，回收率的計(jì)算方法：,（2）質(zhì)控樣品的應(yīng)用： 1）質(zhì)量控制樣品（quality control sample）為了更加準(zhǔn)確的對(duì)樣本進(jìn)行定量，我們使用質(zhì)量控制樣品，它是含有一種或幾種測(cè)定物（其量值是經(jīng)過(guò)標(biāo)定的靶值），用來(lái)比較和評(píng)價(jià)測(cè)定系統(tǒng)的偏差和重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)用血清。2）對(duì)質(zhì)

29、控樣品的要求： A、質(zhì)控樣品中的分析物應(yīng)與待測(cè)樣品具有相同的生物學(xué)活性和免疫原性，其他組成成分也盡量相同。,B、質(zhì)控樣品中分析物的濃度應(yīng)是準(zhǔn)確定量的，并且應(yīng)有一個(gè)合理的濃度范圍，一般根據(jù)患者和正常人血清中被測(cè)物的濃度，制定高、中、低三個(gè)劑量水平，高者應(yīng)小于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大劑量點(diǎn)，中者應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間劑量點(diǎn)，低者應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最小劑量點(diǎn)，這樣能更好得發(fā)現(xiàn)整個(gè)檢測(cè)范圍內(nèi)出現(xiàn)的變化，準(zhǔn)確判斷誤差的性質(zhì)和大小。C、在合理貯存的條件下，能長(zhǎng)

30、時(shí)間保存而不影響其性能，以便監(jiān)控測(cè)定系統(tǒng)的遠(yuǎn)期重現(xiàn)性。D、質(zhì)控樣品的管數(shù)約為總樣品管數(shù)的平方根，使用時(shí)將其分置于待測(cè)樣本的不同位置。,3、 靈敏度（sensitivity）靈敏度是指剛能與零標(biāo)準(zhǔn)管的測(cè)定結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上區(qū)別開來(lái)的最低濃度，即用該方法的最小可測(cè)值。計(jì)算方法是累積多批（一般為10次）測(cè)量結(jié)果，計(jì)算出零標(biāo)準(zhǔn)管的結(jié)合率為x-2SD時(shí)對(duì)應(yīng)的劑量值，即為靈敏度。由此可見，靈敏度和精密度有一定的關(guān)系，當(dāng)精密度好時(shí)，零標(biāo)準(zhǔn)管的結(jié)合率較高

31、，對(duì)應(yīng)的濃度值較小，最小可測(cè)值較小，即靈敏度較高。,4、穩(wěn)定性（stability） 穩(wěn)定性是指測(cè)定試劑在合理保存和正確使用的條件下。在規(guī)定的有效期內(nèi)，保持其全部性能不變。常用指標(biāo)有：（1）零標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合率：是指在沒(méi)有未標(biāo)記配體存在下，由標(biāo)記配體與結(jié)合劑之間產(chǎn)生的最大結(jié)合率，理論上不應(yīng)低于33%，這個(gè)指標(biāo)主要用來(lái)反應(yīng)結(jié)合劑的質(zhì)量，它在整個(gè)有效期內(nèi)應(yīng)保持穩(wěn)定。（2）非特異性結(jié)合率：它是指在沒(méi)有結(jié)合劑的存在下，標(biāo)記配體被分離試劑結(jié)合造成的

32、結(jié)合率，由于檢測(cè)過(guò)程中的種種原因，非特異性結(jié)合總會(huì)或多或少地存在，一般應(yīng)控制在5%以下。,5、特異性（specificity）： 特異性是指該反應(yīng)體系不受干擾物質(zhì)影響的程度，反映的是對(duì)分析物測(cè)定的專一程度。交叉反應(yīng)率越小，反應(yīng)體系對(duì)分析物測(cè)定的專一性越好。 6、有效性（affectivity）： 有效性主要是指臨床診斷符合率及臨床使用評(píng)價(jià)。檢測(cè)結(jié)果能有效地實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?yīng)有可信的正常值及正常范圍，在正常和異常之間應(yīng)有良好的分離，以便

33、得出結(jié)論，如有些要作有或無(wú)、陽(yáng)性或陰性的回答，有些要確定濃度的高低等。,應(yīng)該指出，上面提到的各種質(zhì)控指標(biāo)，對(duì)于全面評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)的質(zhì)量及檢測(cè)者的操作水平雖然是必要的，然而在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)工作中，要完成如此眾多的質(zhì)控指標(biāo)是不可能的，也是沒(méi)有必要的。通常可根據(jù)實(shí)際需要和實(shí)驗(yàn)室條件，選擇數(shù)項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)用于批內(nèi)質(zhì)量控制和批間質(zhì)量控制。,（三）實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量評(píng)價(jià)（external quality control） 實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量評(píng)價(jià)

34、是對(duì)各實(shí)驗(yàn)室之間的測(cè)定結(jié)果按統(tǒng)一的評(píng)價(jià)方案及方法比較分析，發(fā)現(xiàn)誤差，找出原因，提出改進(jìn)辦法，以提高各實(shí)驗(yàn)室之間所得結(jié)果的可信性和可比性。外部質(zhì)量評(píng)價(jià)要在做好內(nèi)部質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上才能進(jìn)行。通常是根據(jù)工作需要，由一個(gè)負(fù)責(zé)單位來(lái)領(lǐng)導(dǎo)，提出計(jì)劃及要求，提供實(shí)施外部質(zhì)量評(píng)價(jià)用的統(tǒng)一樣品，分發(fā)至各參加單位進(jìn)行檢測(cè)，然后將所得結(jié)果反饋給負(fù)責(zé)單位進(jìn)行整理分析，對(duì)各有關(guān)單位的檢測(cè)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，促進(jìn)檢測(cè)質(zhì)量的提高和資料的可比性。,第二節(jié) 免疫放射分析,免

35、疫放射分析是利用過(guò)量放射標(biāo)記抗體來(lái)測(cè)定樣品中的抗原或半抗原。所用的標(biāo)記抗體是過(guò)量的，抗原全部是非標(biāo)記的，所以反應(yīng)系統(tǒng)是非競(jìng)爭(zhēng)性的全量反應(yīng)。為了與放射免疫分析法相區(qū)別，它的創(chuàng)始人Miles一開始就將其命名為免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）并一直沿用到現(xiàn)在。,一、基本原理,放射性核素標(biāo)記在抗體上，然后以過(guò)量標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合，多余的抗體通過(guò)一定手段除去，測(cè)定復(fù)合物的放射性，其活度與待測(cè)抗原的量呈正相

36、關(guān)。由于不存在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，其靈敏度明顯高于RIA。如下式表式：,IRMA中要分離的是游離抗體和復(fù)合物，都是大分子，一般分離方法難以奏效，目前主要靠單克隆抗體作分離劑。也就是每一IRMA系統(tǒng)至少要有兩個(gè)抗體，一個(gè)起分離作用，一個(gè)起測(cè)量作用。所以，一個(gè)IRMA方法的建立，至少需要兩個(gè)抗原決定簇，對(duì)很多小分子半抗原不適用。 （一）IRMA同樣遵循質(zhì)量作用定律 IRMA的函數(shù)式也是雙曲線，若以B為縱坐標(biāo)，它們是隨抗原量增加而

37、上升的曲線。,（二）、 IRMA的測(cè)量范圍寬 抗體含量越大，則欲達(dá)到飽和時(shí)所需要的抗原更多，這說(shuō)明測(cè)量范圍寬。但標(biāo)記抗體過(guò)高，游離抗體的量也增多，分離時(shí)將有明顯的分離誤差，使NSB升高，低濃度抗原的測(cè)量精密度降低。所以標(biāo)記抗體的最佳濃度應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇。,（三）、IRMA和RIA的主要區(qū)別：,二、IRMA分類,（一）、雙抗體夾心法（double antibody sandwich method） 此法采用

38、固相抗體來(lái)代替經(jīng)典的固相抗原的IRMA法，固相抗體先與待測(cè)物（或標(biāo)準(zhǔn)品）結(jié)合，再與標(biāo)記的另一抗體反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，未結(jié)合抗體留在上清液中被棄去，測(cè)固相放射性。如下式表示：,上式中的Ab1、*Ab2分別作為抗原上二個(gè)抗原決定簇的單抗，SP表示固相。,（二）、標(biāo)記雙抗法（labeled double antibody method）,標(biāo)記抗體即為夾心法中那個(gè)標(biāo)記抗體的抗體，亦即雙抗，這樣設(shè)計(jì)是為了簡(jiǎn)化標(biāo)記每一特異性抗

39、體，只要標(biāo)記這個(gè)雙抗體，即可作為通用示蹤劑，例如用125I標(biāo)記了兔抗鼠的IgG，則所有應(yīng)用非固相的鼠抗體作為第二抗體的，均可用此標(biāo)記的抗抗體作為示蹤劑，如下式表示：,（三）、雙標(biāo)記抗體法（double labeled antibody method）） 有些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗原有3個(gè)或更多個(gè)抗原決定簇，為此，可以用兩個(gè)標(biāo)記抗體進(jìn)行IRMA分析，以提高復(fù)合物的放射性比活度，從而提高方法靈敏度和精密度。最后形成的標(biāo)記復(fù)合物見下

40、圖：,三、數(shù)據(jù)處理,采用計(jì)算機(jī)數(shù)學(xué)模型的方法進(jìn)行處理，常用的數(shù)學(xué)模型包括：三參數(shù)單位點(diǎn)質(zhì)量定律數(shù)學(xué)模型、五參數(shù)Logistic模型、線性內(nèi)插模型等。,四、免疫放射分析的特點(diǎn),（一）示蹤劑 IRMA法中的示蹤劑為標(biāo)記抗體，是一種IgG蛋白分子，含有多個(gè)酪氨酸或組氨酸殘基，易被放射性碘化，目前示蹤劑的標(biāo)記多用固相氧化劑碘化法，如Iodogen法等，很少影響其免疫活性，標(biāo)記率可達(dá)70%左右。 （二）反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

41、質(zhì)量作用定律認(rèn)為反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度呈正比，在IRMA中標(biāo)記抗體是過(guò)量的，且反應(yīng)是非競(jìng)爭(zhēng)性的，抗原抗體是全量反應(yīng)，故反應(yīng)速度比RIA法快，一般反應(yīng)2-3小時(shí)即達(dá)平衡，當(dāng)天出結(jié)果。,（三）靈敏度 IRMA的靈敏度比 RIA有明顯的提高，約為10-100倍，這在某些分析項(xiàng)目中具有重要意義。如甲狀腺功能主要指標(biāo)有三項(xiàng)，即FT3、FT4的放免測(cè)定和TSH的IRMA測(cè)定，IRMA測(cè)定TSH能可靠的區(qū)分正常人和甲亢病人血清TSH含

42、量的差別，只要TSH低于正常，F(xiàn)T3或FT4任一項(xiàng)高于正常即可診斷為甲亢，在復(fù)雜情況下，TRH試驗(yàn)時(shí)TSH高于正常，應(yīng)否定甲亢。,（四）標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作范圍 當(dāng)選擇的標(biāo)記抗體質(zhì)和量適當(dāng)，IRMA的工作范圍寬。一般情況下，待測(cè)物含量低者不必濃縮，高者不必稀釋，給臨床檢測(cè)帶來(lái)方便，也避免了由于濃縮和稀釋帶來(lái)的誤差。（五）特異性IRMA應(yīng)用的固相抗體和標(biāo)記抗體是分別針對(duì)抗原的兩個(gè)抗原決定簇的單抗，不易發(fā)生交叉反應(yīng)，因此特異性

43、高。,（六）方法的穩(wěn)健性在免疫反應(yīng)中，有些抗原抗體間的親和常數(shù)KA有明顯的溫度依賴性，降低溫度有利于KA值的提高，有利于增加靈敏度。根據(jù)質(zhì)量作用定律，當(dāng)抗體的濃度大于1/KA，KA的影響就明顯減少。IRMA中Ab0總是過(guò)量的，溫度對(duì)KA的影響較小，一般在4-37℃的溫度改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯影響，所以IRMA常采用37℃溫育，反應(yīng)平衡時(shí)間明顯縮短。方法的穩(wěn)健性好。,（七）IRMA的主要缺點(diǎn) IRMA對(duì)蛋白和多肽抗原的檢測(cè)

44、是優(yōu)越的。但它的典型的兩位點(diǎn)夾心法需要二個(gè)抗原決定簇的抗原，這就大大地限制了對(duì)短肽及其它半抗原活性物的檢測(cè)。,第三節(jié) 其它的非放射性 標(biāo)記免疫分析法,在體外分析方法中，除了放射免疫分析和免疫放射分析外，還包括其它非放射性核素標(biāo)記的免疫分析。如酶標(biāo)記免疫分析，化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定，稀土元素標(biāo)記的免疫分析法等。它們與前者一樣，都是利用抗原與抗體的結(jié)合具有高度特異性這一重要特性，而不同之處只是利用的標(biāo)記示蹤物不

45、同，因而其標(biāo)記物的測(cè)定方法也不同。它們除了與前者同樣具有高度特異性及敏感性外，還克服了放射性核素可能造成的環(huán)境污染，保存期短等缺點(diǎn)，因此得到了廣泛的應(yīng)用。,一、酶標(biāo)記免疫分析法 酶標(biāo)記免疫分析法（enzyme immunoassay，EIA）是以酶代替放射性核素標(biāo)記抗體或抗原作為主要試劑的免疫測(cè)定法。它是將抗原抗體結(jié)合的高度特異性與酶促反應(yīng)的高度敏感性有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，用酶標(biāo)記抗體（抗原），檢測(cè)待測(cè)標(biāo)本中的未知抗原（抗體

46、），當(dāng)相應(yīng)的抗原抗體特異性結(jié)合后，加入相應(yīng)的酶的底物，酶可以高效專一催化和分解底物，生成有顏色的產(chǎn)物。根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺，可以判斷待測(cè)標(biāo)本中有無(wú)特異性抗原（抗體）以及量的多少。本實(shí)驗(yàn)是一種敏感、特異、簡(jiǎn)便，只需一般光譜分析儀器的微量測(cè)定技術(shù)。,二、化學(xué)發(fā)光免疫分析法,化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence‘s immunoassay，CLIA），是以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤劑，將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)

47、與高度特異的抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來(lái)的一種超微量的分析法。其特點(diǎn)是：設(shè)備簡(jiǎn)單，試劑穩(wěn)定，無(wú)放射性污染，自動(dòng)化程度高。,三、稀土元素標(biāo)記的免疫分析法,稀土元素即鑭系元素，其中有銪（Eu）、鈦（Tb）、釤（Sm）、和鏑（Dy）四種元素能發(fā)射離子熒光，這些稀土元素的螯合物，可以與抗原抗體結(jié)合，所以又稱鑭系熒光免疫分析。此螯合劑上的稀土元素在紫外光的激發(fā)下，可產(chǎn)生持續(xù)一定時(shí)間，一定光峰的熒光。而其它非特異性熒光壽命很短，待其衰減后，測(cè)量鑭系元素的特

48、異性熒光，可以完全排除背景熒光的干擾，此法又稱時(shí)間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoimmunoassay，TrFIA）。,本法操作方便，靈敏度高，特異性強(qiáng)，無(wú)放射性，標(biāo)記物穩(wěn)定性好，制備簡(jiǎn)單并可長(zhǎng)期保存，加之曲線劑量寬，自動(dòng)化程度高（分析系統(tǒng)類似放免法）等優(yōu)點(diǎn)，深受生物醫(yī)學(xué)工作者的高度重視，目前國(guó)外生產(chǎn)的TRFIA 試劑盒包括甲狀腺激素、類固醇激素，病毒性肝炎標(biāo)記物、腫瘤相關(guān)抗原、蛋白質(zhì)類、藥物、多肽類和蛋白質(zhì)類激