傅里葉紅外光譜成像技術(shù)

1、,FTIRI 在骨病研究中的應(yīng)用,,,傅里葉變換紅外光譜成像系統(tǒng)（fourier transforminfrared imaging ，F(xiàn)TIRI）12應(yīng)用物理2班 胡文濤 2012326690036,引言,關(guān)于FTIRI 的總結(jié),FTIRI 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)介紹,FTIRI 在骨病研究中的應(yīng)用,FTIRI 系統(tǒng)工作原理和方式,,,,,,引言,關(guān)于FTIRI 的總結(jié),FTIRI 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)介紹,FTIRI 在骨病研究中的應(yīng)用,FTIRI

2、系統(tǒng)工作原理和方式,,,,,,紅外光譜用于生物物理學(xué)和生物化學(xué)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析已有大半個(gè)世紀(jì)。該方法提供了重要的結(jié)構(gòu)信息，例如組織的組成，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和相互作用，DNA 構(gòu)象和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，脂質(zhì)構(gòu)象的排序和相行為等。傅里葉變換紅外（fourier transform infrared ，F(xiàn)TIR）光譜技術(shù)則是在20世紀(jì)80年代后期興起，并在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。,但是這些傳統(tǒng)的光譜技術(shù)存在很多問題，帶來諸多不便。,2001年，

3、珀金埃爾默（Perkin Elmer）公司推出一套傅里葉變換紅外光譜成像（fourier transforminfrared imaging ，F(xiàn)TIRI）系統(tǒng)，即采用高靈敏度的線性陣列探測器并耦合一個(gè)可快速運(yùn)動(dòng)的樣品臺(tái)。該儀器允許紅外光譜成像（Maps 或Images）以獨(dú)立的樣品尺寸采集，和基于FPA 開發(fā)的紅外光譜成像儀器在數(shù)據(jù)采集時(shí)間和操作方便性方面相比較具有更明顯的優(yōu)勢，并降低了噪聲和成本。自FTIRI 技術(shù)出現(xiàn)以來，雖然儀

4、器系統(tǒng)較昂貴，但仍以其強(qiáng)大的功能在各領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。,引言,關(guān)于FTIRI 的總結(jié),FTIRI 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)介紹,FTIRI 在骨病研究中的應(yīng)用,FTIRI 系統(tǒng)工作原理和方式,,,,,,目前世界著名的紅外光譜學(xué)顯微成像系統(tǒng)的生產(chǎn)公司包括Bio‐Rad （現(xiàn)在是Digilab／Varian） ， Perkin Elmer （PE） ，Thermo‐Fisher Nicoli ，Bruker 等。這些紅外光譜顯微成像系統(tǒng)基本上是由紅

5、外光譜儀和紅外顯微鏡系統(tǒng)兩大部分組成。僅以最具代表性的PE 公司的Spotlight 300 系統(tǒng)為例，描述紅外光譜學(xué)顯微成像系統(tǒng)的原理和構(gòu)成。,該系統(tǒng)是由一個(gè)紅外光譜儀（Spectrum One）耦合一個(gè)Spotlight 300 顯微鏡裝置。系統(tǒng)內(nèi)部包含一個(gè)16 × 1 單元（400 μm × 25 μm）HgCdTe （MCT） 線性陣列探測器（如引言中所述）和一個(gè)單點(diǎn)（100 μm × 100 μm

6、 ）MCT 探測器，并以液氮置于Dewar 瓶中進(jìn)行冷卻。這兩個(gè)探測器均是在液氮溫度下以光敏（光電導(dǎo)）模式工作。二者所探測的最低光譜范圍可從720 cm － １ （后者甚至可更低一些）開始。,顯微裝置中配以物鏡和聚光鏡（condenser）實(shí)現(xiàn)成像的６× 放大，數(shù)值孔徑為０.５８ ?！咎囟ǖ墓鈱W(xué)設(shè)計(jì)允許樣品區(qū)域在探測器單元上實(shí)現(xiàn)１ ∶ １ 和４ ∶ １ 成像，從而達(dá)到２５ × ２５ 和６.２５ μm × ６

7、.２５ μm 正常空間分辨率（實(shí)際的空間分辨率是和波長相關(guān)的，并由衍射限來決定的） 。光譜可以以快速掃描的模式（最大速率８０ pixels／s）進(jìn)行采集?！靠梢姽獬上瘢ㄒ曈X影像Visual image）的收集則通過一個(gè)CCD 相機(jī)結(jié)合計(jì)算機(jī)控制（亦可手動(dòng)操作）的顯微鏡樣品臺(tái)的運(yùn)動(dòng)來最終實(shí)現(xiàn)?？梢姽獬上竦氖占窃诎坠釲ED 的照射下“拼接”而成。而后在可見光成像區(qū)域內(nèi)選擇感興趣的區(qū)域進(jìn)行紅外光譜成像。因?yàn)橄到y(tǒng)集成陣列探測器和運(yùn)動(dòng)樣品臺(tái)，所

8、以紅外光譜成像數(shù)據(jù)采集速度較快。具體速度還與光譜分辨率及空間分辨率有關(guān)，分辨率越高則采集時(shí)間越長。,引言,關(guān)于FTIRI 的總結(jié),FTIRI 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)介紹,FTIRI 在骨病研究中的應(yīng)用,FTIRI 系統(tǒng)工作原理和方式,,,,,,根據(jù)樣品的特點(diǎn)、性質(zhì)和測量要求選擇測量或成像模式，通常有反射模式和透射模式。針對(duì)不同的成像模式，所采用的載玻片也截然不同。對(duì)于透射模式，因?yàn)槭菍?shí)現(xiàn)透射測量，所采用的載玻片多是在紅外波段幾乎全透的BaF２ 晶片，

9、從而可最大限度地減少客觀條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。因?yàn)橥干淠Ｊ娇商峁┳詈玫男旁氡群洼^好的光譜質(zhì)量，但是光譜強(qiáng)度卻容易受到樣品厚度和樣品吸光度的影響，所以更適用于測量透光性較好的樣品。,相比較于透射模式，反射模式則是在制樣和操作上更易實(shí)現(xiàn)的一種成像模式。為了保證成像和光譜質(zhì)量，對(duì)于載玻片亦有特殊要求。在中紅外波段，多采用特制的表面鍍銀的（low‐emission）載玻片，降低了實(shí)驗(yàn)成本。此種載玻片對(duì)LED 發(fā)出的白光透射而對(duì)紅外光反射（反透射

10、） ，從而可順利實(shí)現(xiàn)可見光成像和紅外光譜顯微成像，同時(shí)進(jìn)一步提高紅外成像的質(zhì)量。,透射模式,反射模式,成像模式選擇之后，將樣品置于紅外顯微鏡的樣品臺(tái)上，進(jìn)行Z 軸方向的上下調(diào)節(jié)從而可實(shí)現(xiàn)LED 白光和入射紅外光有效聚焦到待測樣品位置。在清晰聚焦之后，調(diào)節(jié)（移動(dòng)）樣品臺(tái)來確定可見光成像區(qū)域。在可見光成像的基礎(chǔ)上選擇ROI（region of interest）進(jìn)行紅外光譜顯微成像。,通過樣品臺(tái)的精確移動(dòng)和探測器對(duì)樣品的同步掃描和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)

11、處理，獲得ROI 的每個(gè)像素的XY 坐標(biāo)和紅外光譜。這些探測器測量目標(biāo)范圍內(nèi)全波段光譜的平均吸收率（或透射率） ，并采用一定的顏色（范圍）來表示，即（Artifact），從而ROI 顯示以彩色圖像。在任意像素所對(duì)應(yīng)的紅外光譜上選擇某特征譜帶，即可衍生出該特征譜帶所對(duì)應(yīng)的特征基團(tuán)或該基團(tuán)所代表的某特征成分在樣品的ROI 內(nèi)的分布情況，此即成分圖像（Chemical Image） 。從而可形象直觀的分析樣品組分、結(jié)構(gòu)特征、特征基團(tuán)的空間分布

12、及其變化等。,引言,關(guān)于FTIRI 的總結(jié),FTIRI 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)介紹,FTIRI 在骨病研究中的應(yīng)用,FTIRI 系統(tǒng)工作原理和方式,,,,,,傳統(tǒng)紅外光譜學(xué)可研究鑒別骨中羥磷灰石的存在和定量研究骨中取代基，譬如碳酸鹽和酸式磷酸鹽的存在，可提供均勻分布的組織中的晶體尺寸和完整度，有利于研究骨質(zhì)疏松性骨折。但是主要是針對(duì)均勻骨質(zhì)。FTIRI 技術(shù)的出現(xiàn)則有利于進(jìn)一步研究這些硬組織當(dāng)中的空間異質(zhì)性，即其較高的空間分辨率和豐富的光譜信息有利于

13、研究和表征從硬組織的表面到內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和成分分布差別。盡管組織化學(xué)和X 射線顯微照相技術(shù)可觀察到這些空間變化，但是FTIRI 技術(shù)則可提供更精確的定量描述。因此骨的異質(zhì)性或不均勻性等特性決定了FTIRI 適宜進(jìn)行和年齡、位置變化等相關(guān)的空間分辨的研究，從而可定量判定骨的空間含量或空間差異 、成分和性質(zhì)以及飲食、環(huán)境和具體的蛋白質(zhì)（發(fā)生基因突變等）的影響，同時(shí)也為生物醫(yī)學(xué)的研究的開辟了一個(gè)新的研究領(lǐng)域并提出了治療依據(jù)。,,FTIRI 最重要

14、的應(yīng)用就是對(duì)骨病的發(fā)展及修復(fù)的監(jiān)測 ，用于無損表征骨樣品切片的成分，闡明在骨折愈合期間以及一些流行疾病（如骨質(zhì)疏松癥 ）和罕見疾?。ㄈ绯晒遣蝗Y和骨石化病 ）當(dāng)中礦物質(zhì)和基質(zhì)的變化。FTIRI 可通過對(duì)礦物質(zhì)的定性定量分析來研究這些疾病。,,,,,成骨不全,骨石化病,骨質(zhì)疏松,骨軟化癥,,,,,,,,,,,,,,,,成骨不全（osteogenesis imperfecta） ，也稱骨脆癥，是一種具有罕見遺傳性的易碎骨病。此病的患者具有高

15、的骨折風(fēng)險(xiǎn)，最終歸因于膠原蛋白基因的變異位置。,FTIRI 提供了這樣一個(gè)有利條件，從而能夠弄清楚膠原蛋白分子內(nèi)不同的變異對(duì)礦物質(zhì)沉積的影響。Atti 等采用該技術(shù)研究了骨中轉(zhuǎn)化生長因子的不足對(duì)骨中礦物質(zhì)和骨基質(zhì)的影響。從礦物質(zhì)的含量、結(jié)晶度和膠原的成熟度三個(gè)參數(shù)，以及從同一個(gè)樣本選擇若干個(gè)區(qū)域（從二級(jí)骨化中心到遠(yuǎn)端骨干）來表征骨的發(fā)展的幾個(gè)不同階段。結(jié)果顯示受損骨的成熟機(jī)制直接涉及到生長轉(zhuǎn)化因子的不足以及間接的炎性細(xì)胞因子的增加。FT

16、IRI 技術(shù)和組織結(jié)構(gòu)力學(xué)相結(jié)合還被成功地應(yīng)用于測量種內(nèi)變異的老鼠的骨骼中礦物和基質(zhì)組成 。研究發(fā)現(xiàn)了礦物質(zhì)‐基質(zhì)比及碳酸鹽‐磷酸鹽比的不均勻性和結(jié)晶度變化的關(guān)系：股骨斷裂暗示著礦物質(zhì)‐基質(zhì)比和碳酸鹽‐磷酸鹽比的不均勻性減少，同時(shí)骨的剛性降低的概率增加，導(dǎo)致斷裂；結(jié)晶度的不均勻性增加，則和碳酸鹽‐磷酸鹽比的減少有關(guān)。,骨石化?。∣steopetrosis） ，此病患者的骨骼象巖石般堅(jiān)硬，阻礙了她們的移動(dòng)且增加了她們的痛苦。很多患者

17、中，此病的起因是骨的再吸收細(xì)胞和破骨細(xì)胞不能夠?qū)沁M(jìn)行重建，導(dǎo)致軟骨的持續(xù)鈣化。FTIRI 研究數(shù)據(jù)證明了礦物質(zhì)含量的增加和晶體尺寸的降低，與在患有此病的動(dòng)物模型的骨內(nèi)所觀察到的特性是一致的 。,與其他較罕見的骨病相比較，骨質(zhì)疏松癥osteoporosis是一種很普通的與年齡相關(guān)的疾病。它的發(fā)生涉及到骨或骨小梁的損失。FTIRI 應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的研究之前，一系列的紅外光譜和X‐ray 衍射研究表明：與年齡一致的健康骨骼相比較，骨質(zhì)疏松

18、癥患者體內(nèi)的礦物質(zhì)含量連續(xù)降低，而晶粒尺寸和完善程度將增加、減少或者不變。但是具體的變化方式尚未有定論。應(yīng)用紅外顯微光譜及其成像技術(shù)恰可以完美地揭示這些變化，包括骨的超結(jié)構(gòu)，能鑒別這些在正常組織和骨質(zhì)疏松組織之間的重要的差別，并排除斷裂面的愈合組織或者微裂縫。通過對(duì)大量患有骨質(zhì)疏松癥的男女患者的活檢（多位置）分析，發(fā)現(xiàn)礦物質(zhì)和基質(zhì)比降低，而結(jié)晶度增加，膠原蛋白成熟度也在增加。,FTIRI 還被用于研究骨軟化癥（osteomalacia）

19、，其不同于骨質(zhì)疏松癥?！驹诨加泄琴|(zhì)疏松癥的骨中，礦物質(zhì)的密度是逐漸減少的，骨的微體系結(jié)構(gòu)被破壞，骨中非膠原蛋白的數(shù)量和種類發(fā)生變化，以上因素導(dǎo)致骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加?！慷鴮?duì)于骨軟化病，則是因?yàn)橛腥毕莸墓钱?dāng)中骨鹽（骨中的礦物質(zhì)）沉積引起的骨變軟的泛稱。FTIRI 研究揭示了骨中礦物質(zhì)和基質(zhì)的屬性，發(fā)現(xiàn)骨軟化癥患者的骨小梁區(qū)域礦物質(zhì)含量明顯比標(biāo)樣的低，礦物質(zhì)的結(jié)晶度在骨小梁中趨于減少 。,FTIRI 分析對(duì)骨的研究也有一些局限性。首先，因?yàn)楣鞘且?/p>

20、種硬組織，薄的切片較難于制備。為了避免這個(gè)問題，骨通常被固定然后包埋在較硬的基底里面，從而可以用顯微切片機(jī)進(jìn)行切片制樣。然而，這種方法比較耗時(shí)，而且所采用的包埋材料的光譜會(huì)覆蓋骨的礦物質(zhì)成分和基質(zhì)成分的光譜。此外，針對(duì)于人體研究的活檢樣品較難于獲得，因而可用于分析的樣品數(shù)量以及研究結(jié)果通用性受到了限制。,引言,關(guān)于FTIRI 的總結(jié),FTIRI 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)介紹,FTIRI 在骨病研究中的應(yīng)用,FTIRI 系統(tǒng)工作原理和方式,,,,,,盡管

21、FTIRI 在制樣時(shí)有一定限制，但瑕不掩瑜。FTIRI技術(shù)把光譜測量和微區(qū)成像技術(shù)有效地結(jié)合起來，同時(shí)采集樣品的形態(tài)學(xué)信息和光譜信息，實(shí)現(xiàn)了樣品成分的可視化、微區(qū)化、圖像和光譜分析的高精度和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的紅外光譜學(xué)方法相比不僅是實(shí)驗(yàn)技術(shù)的重大突破，同時(shí)也開辟了很多新的研究領(lǐng)域，給各學(xué)科領(lǐng)域研究帶來了深遠(yuǎn)的影響，極大地提高了科學(xué)研究的效率和光譜技術(shù)的通用性。FTIRI 系統(tǒng)的出現(xiàn)不僅為材料、化學(xué)、環(huán)境分析等學(xué)科的發(fā)展提供了有力的