外周血培養(yǎng)及核型分析

1、綜合性實驗外周血培養(yǎng)及核型分析,細胞培養(yǎng)技術(shù)是目前生命科學研究領(lǐng)域的一項常用而重要的技術(shù)，它涉及的技術(shù)有：無菌操作技術(shù)、細胞分離技術(shù)、細胞培養(yǎng)技術(shù)、顯微攝影技術(shù)、圖像分析技術(shù)等。 Moorhead和Levan等(1960)建立的人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)技術(shù)，以及Rothrels等(1958)建立的氣干法制片技術(shù)，成了研究人與哺乳類染色體的最主要技術(shù)。,一、實驗?zāi)康暮鸵?1、 掌握無菌操作的原理和方法；2、 掌握外周血培養(yǎng)的原

2、理和方法；3、 掌握顯微攝影和圖象分析的原理和方法；4、 掌握外周血淋巴細胞染色體制備的技術(shù);5、 綜合運用已掌握的知識基礎(chǔ)和已具備的 實驗?zāi)芰Γ岣呖茖W研究的綜合素質(zhì)。,二、實驗原理,細胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞在體外長期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，共給細胞存活所必需的條件。如供給適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及有關(guān)的生長因子；氧氣及適宜的溫度；注意調(diào)節(jié)其外環(huán)境的酸堿度（pH）與

3、滲透壓；以及為排除細胞代謝產(chǎn)物的危害，保持良好適宜的外環(huán)境而進行必需的傳代等等。所有這一切條件與操作都要保持在無菌條件下進行。,外周血淋巴細胞是不能增殖的分化細胞群，在體外無菌培養(yǎng)條件下，若于培養(yǎng)基中植物凝集素(PHA)則可刺激處于G。期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，重新有絲分裂的能力，經(jīng)一段時間的培養(yǎng)即可獲得大量分裂期細胞以供染色體分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通過干擾微管組裝而抑制紡錘絲形成，使細胞分裂順利進入后期而停滯于中期，從而可

4、在短期內(nèi)積累大量最適于進行染色體分中期分裂相。此外，秋水仙素還能使染色單體縮短、分開，使染色體呈現(xiàn)明顯形狀而利于辨認。,染色體標本制備過程中有兩個重要環(huán)節(jié)， 原理如下：(1)低滲處理：目的是使水分通過細胞膜向細胞內(nèi)滲入，導致轉(zhuǎn)化的淋巴細胞，染色體進一步分散而利于分析。同時，低滲處理還可使紅細胞質(zhì)膜破裂，經(jīng)后血影浮于上清中被去除，后續(xù)的固定過程主要針對淋巴細胞，改善了淋巴細固定質(zhì)量及標本質(zhì)量。(2)固定：目的在于盡快使細胞的結(jié)構(gòu)固

5、定于接近存活的狀態(tài)，以便作進一步處理，若不固定則可因細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解而導致結(jié)構(gòu)變化。染色體研究中常用固定液為甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸滲透力強，固定迅速，但易使組織膨脹而甲醇則可使組織收縮，兩者混合使用能抵消各自的缺點，得到較好的固定效果。,三、實驗用品,(1)器材：冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、離心機、超凈工作臺、無菌培養(yǎng)瓶、10ml離心管、顯微攝影裝置。（2）試劑：RPMI 1640或Eagles MEM培養(yǎng)液、小牛血清

6、(FCS)、PHA、秋水仙素、O．075M KCl、甲醇、冰醋酸；肝素、Giemsa、pH6．8的PBS。（3）材料：動物外周血,四、實驗方法（實驗操作要點）,(1)采血：用肝素潤濕注射針筒(0.2m1)后，常規(guī)取靜脈血約1～2ml，轉(zhuǎn)動針筒混勻肝素。（2)接種(在超凈工作臺中無菌操作)：在每個培養(yǎng)瓶中(含20％血清的1640培養(yǎng)液5ml，pH7．2)，加入全血O．25～O．30ml(7號針頭13～15滴)、PHA 5mg，蓋緊膠塞

7、，輕輕搖勻后。（3)培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。終止培養(yǎng)前2～4 h，加入O·01％秋水仙素溶液(100μg／m1)1～2滴(7號針頭)，使終濃度為0．2μg／ml培養(yǎng)液。輕輕搖勻后，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2～4h。,(4)收獲：將培養(yǎng)后的血細胞收集在離心管中，平衡后1 000r／min離心8 min，棄去上清。（5)低滲：向離心管中加入37℃ 0.075 mol／L KCl溶液至8ml，用吸管輕輕吹打混

8、勻細胞，置于37℃水浴箱溫育15 min。（6)預(yù)固定：向離心管中滴加新配制的甲醇一冰醋酸固定液1～2 ml，用吸管輕輕吹打混勻后1000r／min離心8min，棄去上清。(7)固定：加入新配制的固定液至8 ml，室溫靜置30 min。1 000 r／min離心8min，棄去上清?？稍僦貜?fù)固定1次。,（8)制片：根據(jù)沉淀細胞的多少，加入適量新鮮固定液(O．5～lml)，輕輕吹打制成細胞懸液。用滴管吸取少量細胞懸液，滴至冰冷的載玻片上

9、，立即甩口。吹散，酒精燈火焰過一下，冷風吹干或氣干。(9)染色：1：10 Giemsa染液(pH 6．8)染色10～20 min。流水沖洗，晾干，鏡檢。（10）攝影分析：選好的分裂相進行顯微攝影，并用圖象分析軟件進行核型分析。,五、實驗說明（注意事項）,(1) 無菌操作是培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，采血時要注意無菌操作，試劑配置要進行無菌過濾，所用培養(yǎng)器械要進行滅菌處理。(2) PHA添加很重要，如保存不善，效價低或數(shù)量不足，則作用差，但

10、濃度過大，紅細胞凝塊，這些都會影響細胞生長。(3) 秋水仙素用量過大，染色體過度收縮，乃至染色單體離散，用量過小則影響分裂相。(4) 低滲處理極為重要，低滲不夠，則染色體聚在一起，分散不好。太過，則造成細胞破碎，染色體丟失。,(5) 離心速度太高，細胞團塊不易打散，速度太低，則會丟失細胞。(6) 細胞太多或太少亦能影響分裂相的多少，及標本質(zhì)量。（7）機械打散細胞團時，用力要適度，若用力過猛，細胞易破碎，染色體不完整。(（8)．